结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学

DNA芯片、基因中断、基因互补法、差示荧光诱导法、生物信息学、蛋白质组、DNA库免疫、细菌人工染色体库是结核分枝杆菌研究的主要方法。综合利用上述技术可能是我们开展结核分枝杆菌功能基因组学研究的最佳切入点。     

结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片的制备及应用

目的:用重组结核分枝杆菌ESAT6、CFP10、M16和M38抗原制备相应的抗体检测蛋白芯片。方法:将制备的结核分枝杆菌抗原ESAT6、CFP10、M16和M38及购买的LAM抗原点于醛基化修饰的玻片上,制备成结核抗体检测蛋白芯片;使用该芯片对130例临床结核病患者和50例健康体检者血液样品进行检测,分析其敏感性和特异性,以及5项结核抗体的构成比。结果:结核杆菌抗体检测蛋白芯片的敏感性为90.8%(118/130),特异性为90%(45/50),LAM的检出率最高为91.5%。结论:用ESAT6、CFP10、M16和M38及LAM抗原制备的结核杆菌抗体检测蛋白芯片用于结核病辅助诊断的敏感性和特异性较高,可用于结核分枝杆菌抗体检测蛋白芯片试剂盒的开发。     

结核分枝杆菌FurB蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的:制备针对结核分枝杆菌FurB蛋白的单克隆抗体(mAb)并分析其特性。方法:利用E.coli DH5α表达含有6×His的融合蛋白FurB;采用小鼠腹股沟皮下包埋硝酸纤维素膜的方法免疫小鼠,然后进行细胞融合、克隆化制备抗FurB mAb,用ELISA法初步鉴定其特异性位点和相对亲和力。结果:获得了高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量15.0×10~3处有特异的目的蛋白条带。用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了抗FurB mAb。结论:所获得的抗FurB mAb效价高、特异性强,为进一步研究FurB在结核分枝杆菌铁调控和致病过程中的作用提供了有效工具。     

结核分枝杆菌重要诊断用抗原研究进展

血清学试验是结核诊断的重要依据。随着科学技术的进步,新的结核诊断用抗原不断被发现。我们简要综述了结核菌素蛋白衍生物、抗原85复合体、38kDa磷酸盐转运蛋白、6kDa早期分泌性蛋白、10kDa培养滤液蛋白、免疫性蛋白MPT64、主要分泌性免疫蛋白MPB70、表面脂蛋白MPB83等8种结核分枝杆菌重要抗原作为结核诊断用抗原的研究进展。     

哺乳动物Toll样受体对结核分枝杆菌的控制

针对胞内菌结核分枝杆菌最为有效的免疫应答主要取决于天然免疫应答对侵入细菌的早期发现及获得性免疫应答的活化。Toll样受体在天然免疫应答发现分枝杆菌相关性分子和介导抗菌效应分子的分泌上起作用。它能调节一些免疫调节分子,这些分子能促进基于Th1细胞的T细胞发育。因此,Toll样受体的活化在抗微生物感染的机制上起一定的作用。     

人结核分枝杆菌特异性核酸探针制备及结核病PCR检测技术的初步临床应用

采用人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis TB)染色体DNA为模板,选择位于插入片段IS6110中884～865和568～588碱基对处的两个片段为引物,扩增出317bp的特异性片段．将其克隆进pUCl9载体。酶切图谱分析和DNA序列测定证实为目的片段。该片段经DIG标记,分别与11种分枝杆菌DNA进行Southern杂交,结果证明只与人型复合分枝杆菌发生杂交反应。利用该对引物建立的PcR检测拄术对74份结核病痰液标本进行检测,并与临床细菌快速培养结果相比较,发现48份临床阳性均为PcR阳性,在26份临床阴性标本中亦发现11份PCR检测阳性。将标本PCR产物与克隆探针进行杂交,显示两者结果完全一致。说明PCR检测体系结果可靠,其灵敏度明显高于目前临床所采用的方法,可作为一种常规技术用于结核病的临床检测。     

结核病人感染人类免疫缺陷病毒导致血浆中和结核分枝杆菌诱生的细胞因子变化

在全球感染性疾病中,结核病仍是导致死亡的最普遍的原因之。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染与结核病有着密切联系,它能加剧结核病的发展,结核病又可促进HIV的复制,加速艾滋病的发作。机体对结核分枝杆菌(简称结核杆菌)的抵抗主要依赖细胞免疫,T细胞产生的细胞因子与结核杆菌感染密切相关。Th1细胞活化分泌IFN—r,激活巨噬细胞对控制感染起着重要作用。     

用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmU基因

目的:结核分枝杆茵glmU基因是分枝杆菌生长必需基因,其编码产物具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性,参与细胞壁前体物UDP-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)的生物合成,研究其空间结构可以定向设计酶抑制剂.方法:利用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmO基因,并用大肠杆菌BL21(DE3)高表达m-GlmU蛋白.结果:获得了定向突变的结核分枝杆菌glmU基因,m-glmU.纯化的m-GlmU蛋白仍具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶核苷转移酶活性.结论:纯化的m-GlmU蛋白为进一步研究其稳定性、测定其空间结构提供了物质基础.     

分枝杆菌噬菌体在结核病诊断、耐药筛选中的应用研究

随着耐药结核分枝杆菌的传播,结核病的防治面临巨大挑战,结核分枝杆菌的快速诊断和耐药性筛选和新型治疗药物的研发是结核病防治的关键。噬菌体生物扩增法是一种经济、快速、易操作且不需要特殊仪器的表型实验技术,最近几年发展很快。本文综述了分枝杆菌噬菌体在结核病的诊断、耐药筛选中应用的最新进展。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与结核分枝杆菌相互作用的研究

目的:检测LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞A549上的表达情况,及结核分枝杆菌刺激后对其表达的影响,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中所起的作用。方法:体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,在结核分枝杆菌感染A549细胞0h,24h分别提取RNA,采用RT-PCR的方法检测LC3mRNA的表达情况。采用凋亡坏死染色试剂盒在结核分枝杆菌感染24h后检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组的细胞坏死情况。在结核分枝杆菌感染A549细胞4h,8h,16,24h采用Non-Radioactive Cytocity Assay的方法检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值。结果:LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞显著表达,结核分枝杆菌感染后LC3表达降低。细胞凋亡和坏死染色结果显示空白组和3-MA组没有明显差异(P>0.05),MTB组和3-MA+MTB组有明显差异(P<0.05)。LDH检测显示MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值数据两两之间有明显差异(P<0.05)并且有时间依赖性。结论:肺泡II型上皮细胞自噬体在抵抗结核分枝杆菌的感染过程中起一定的作用。