结核分枝杆菌信号转导与耐药的研究进展

摘要:结核分枝杆菌感染每年导致200万人口死亡,而化疗已经产生了严重的广泛传播的耐药性。信号转导系统是细菌适应周围环境变化的重要分子机制,是否介导细菌耐药性的产生,尚无清楚的认识。本文主要介绍了结核分枝杆菌的12对二元信号转导系统并分析了其与耐药性产生的关系。通过对近期研究的分析,我们发现MprB/A、PhoR/P、DosR/S/T、SenX3/RegX3、MtrB/A五对二元信号转导系统有可能通过不同的机制使结核分枝杆菌对抗结核药物发生耐药性,因此二元信号转导系统是有效的调控靶位点,有可能应用小分子化合物靶向调节二元信号转导途径以逆转耐药。     

结核分枝杆菌四联核酸疫苗免疫原性和保护效率

对结核杆菌四联DNA疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价. 用结核分枝杆菌Ag85B, MPT-64, MPT-63和ESAT-6等4个分泌蛋白基因的表达载体首次免疫小鼠21 d后, Ag85B抗体滴度达到1︰200, 二次免疫后为1︰102400, 三次免疫后为1︰12800. MPT-64和MPT-63的抗体滴度在首次免疫21 d后即高达1︰25600, 二、三次免疫后呈下降趋势. 三次免疫21 d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体. 用该DNA四联苗免疫小鼠后, 4种蛋白都诱导脾脏细胞产生较高水平的细胞应答(产生了特异性g-干扰素). 三次免疫后经静脉强毒攻击, 四联苗免疫组小鼠肺脏的细菌数比对照空载体组减少了99.8%, 保护水平显著高于BCG疫苗组. 对肺组织的病理形态特征观察表明, 空载体pJW4303 的对照小鼠, 肺部严重损伤, 肺实质干酪样坏死, 坏死结节占肺实质的50%~70%, 而四联苗免疫的小鼠, 肺组织结构正常, 实质无肉芽肿, 肺泡轮廓清晰. 研究证实, Ag85B, MPT-64, MPT-63和ESAT-6四种分泌蛋白编码基因组成的四联DNA疫苗具有很高的免疫应答水平和保护效率.     

泌尿系结核行肾切除术76例临床分析

目的:总结泌尿系结核行肾切除术患者的临床特点,探讨诊治对策。方法:回顾分析2002年1月至2009年1月在我院施行肾切除术的泌尿系结核患者的临床资料。结果:入组76例,常见主诉为:尿路刺激症状(72.4%),血尿(46.1%),肾区疼痛(40.8%)等。常用检查手段:尿常规异常率为82.9%,B超诊断率为21.1%,静脉肾盂造影诊断率为51.6%,CT诊断率为75.0%。所有患者均经抗结核药物治疗。肾切除治疗效果满意。结论:降低泌尿系结核患者肾切除率的关键在于早期诊断,规范抗结核治疗。应加强对该病的认识,仔细分析病史,熟悉该病临床表现,各检查结果特点。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

分枝杆菌枝菌酸合成及其调控

结核病是危害人类健康的重要传染病,每年200多万人死于结核病。耐(多)药菌株的出现、与HIV共感染以及人口老龄化等原因与全球结核病的卷土重来密切相关。枝菌酸是存在于结核分枝杆菌、其他分枝杆菌和许多放线菌的细胞壁中的关键组分,与结核分枝杆菌的致病、毒力和免疫逃避都有关系。枝菌酸在抗结核研究中有着极其重要的地位。结核分枝杆菌枝菌酸的生物合成途径一直是很重要的抗结核药物靶标,异烟肼、乙胺丁醇等抗结核药物都是以此为靶标。深入研究枝菌酸的合成、调控有助于发现更多的药物靶标,为开发结核病控制新措施提供基础。本文综述了结核分枝杆菌枝菌酸的结构与分类、生物合成途径及其调控、作为抗结核药物靶标的前景与应用,以期对枝菌酸有更深入的了解并为新型抗结核药物靶标的发现提供基础。     

结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值

目的:对结核分枝杆菌Rv3425蛋白进行生物信息学分析及抗原表位预测,评价Rv342519-176重组蛋白与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用。方法:PCR扩增结核杆菌Rv3425蛋白19～176位的编码基因片段,原核表达并纯化Rv342519-176重组蛋白(rRv342519-176)和CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6),建立以重组蛋白为抗原的ELISA方法,评价2种蛋白在结核抗体检测中的联合应用价值。结果:具有抗原表位的rRv342519-176与rCFP10-ESAT6在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,rRv342519-176的敏感性为39%,特异性为97.5%;rCFP10-ESAT6的敏感性为37%,特异性为95%;2种蛋白联合检测,敏感性提高到57%,特异性为95%。结论:生物信息学预测Rv3425的优势抗原表位,表达并纯化的rRv342519-176和rCFP10-ESAT6在结核抗体检测中具有一定的抗原互补性,在保持特异性的基础上可显著提高检测敏感性。     

结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化

在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv3369蛋白,获得纯化的重组蛋白rRv3369。通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv3369基因;以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv3369在大肠杆菌中的表达,确定rRv3369在大肠杆菌中的表达形式;采用Ni-NTA His.Bind Resin来纯化重组蛋白。重组质粒pET28a-Rv3369中目的基因测序结果与报道序列相同。分子量约19.5kDa,表达量约占菌体总蛋白的18%,纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%以上,每100mL培养菌可获得1.56mg左右的重组蛋白。用亲和层析法纯化的重组蛋白纯度较好。     

结核分枝杆菌FtsZ的异源表达及酶学性质研究

作为细菌分裂所必需的微管蛋白类似物,丝状温度敏感蛋白Z(filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)被认为是一个具有潜力的药物作用新靶点。为了构建高纯度的FtsZ重组蛋白分离纯化体系,探讨其酶学性质,该研究利用大肠杆菌BL21异源表达结核分枝杆菌FtsZ重组蛋白,通过Ni亲和层析柱和G-50层析柱纯化目的蛋白,采用孔雀石绿法和90°光散射法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活和蛋白聚集。研究结果表明:成功获得具有生物学活性的结核分枝杆菌FtsZ重组蛋白,其相对分子质量约为49kD;该酶最适反应温度为37℃,最适pH为6.8,金属离子Mg~(2+)和K~+对FtsZ重组蛋白酶活具有促进作用,有机溶剂DMSO和TritonX-100的体积分数分别高于0.1%和0.005%时对酶活有显著抑制作用(P0.05)。此外,FtsZ重组蛋白在加入底物GTP诱导后,快速聚集。本实验利用基因工程技术成功获得具有生物活性的FtsZ重组蛋白,并明确了该蛋白质的酶学性质,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展

结核分枝杆菌是一种胞内感染菌,巨噬细胞是其寄生场所。结核分枝杆菌通过阻止吞噬溶酶体的融合、减少巨噬细胞凋亡、降低巨噬细胞对刺激应答的敏感性等途径逃避巨噬细胞的免疫监视和攻击,并在细胞内存活、增殖;而巨噬细胞又是抗菌免疫的主要效应细胞,通过直接杀伤和分泌多种细胞因子,对结核分枝杆菌具有免疫调节、呈递抗原等作用。深入研究结核分枝杆菌对巨噬细胞的免疫逃逸机制及巨噬细胞抗结核免疫作用,对研究宿主抗结核免疫机制及设计新型结核病疫苗有重要意义。