嗜极微生物研究新进展

在报道嗜极微生物多样性时涉及到结晶盐的微生物世界,在这种特定环境中生存的微生物,研究把它们列为古菌域(Arehaea)行列,这个名称曾把它叫古细菌(Arehaebacteria),后认为叫古菌为好;而在某些“微生物学”教科书或论中也有把它称为古生菌,可是在真菌中已有这个“古生菌”     

3种方法检测体外神经细胞存活的技术探讨

为了准确、客观、快速、高效地反映体外培养细胞存活的情况,将PC12细胞以不同密度接种于96孔板中,培养48h后,然后采用结晶紫比色法,中性红比色法,MTT比色法来检测细胞的存活情况,再将所得结果进行比较,比较3种方法的优缺点,寻求最佳检测细胞存活方案．结果发现,不同方法检测细胞存活的范围各不相同．其中结晶紫比色法细胞存活数与比色光吸收值（absorbance value,A值）呈正相关程度较其它两种好,而且检测细胞存活范围最为宽广．     

腾冲嗜热厌氧杆菌6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表达与结晶及其功能鉴定

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (PbgL,EC 3.2.1.86) 催化由磷酸烯醇式丙酮酸 糖磷酸转移酶系统(PEP-PTS)转运入胞内的某些磷酸化二糖水解．一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis) 编码PbgL (436个氨基酸残基) 的开放阅读框 (ORF TTE0337)被成功克隆,并在大肠杆菌BL21(Escherichia coliBL21)中有活性地表达．序列分析显示,该6-磷酸-β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族4(GH4),与枯草杆菌(Bacillus subtilis)的LicH,海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)的BglT的一致性分别为62%和40%．纯化后的重组PbgL(rPbgL)经SDS-PAGE分析,为1条分子量约50 kD的蛋白条带,与推测的分子量大小一致．该酶需要Mn²⁺、NAD⁺ 和 还原剂为辅因子,能专一性地水解pNPβG6P,并在85 ℃达到最高酶活性．Western免疫印迹实验,利用针对rPbgL的多克隆抗体血清,能从腾冲嗜热厌氧杆菌胞内检测到PbgL的表达．此外,rPbgL的蛋白晶体已被筛选获得,并收集到2.4Å分辨率的衍射数据．采用分子置换法的结构解析目前仍在进行中．     

Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究

Rhodococcus ruber CGMCC309菌株为酰胺酶及腈水解酶双重缺陷菌株,研究表明该菌能产宽泛底物特异性的腈水合酶。对该菌株产生的新型腈水合酶(NHase-3090)进行纯化和结晶,并研究了其酶学性质。采用疏水、离子交换及凝胶过滤3种层析方法,使该酶纯化倍数达到17.14,得率高达26.2%。电泳分析表明,全酶分子量为105 kDa,由α(24.3 k Da)和β(28.0k Da)2个亚基组成,并构成α2β2四聚体。酶的最适p H和温度分别为7.5和30℃。该酶明显受不同金属离子影响。动力学研究表明,Km为178.8 m M;Vmax为209.1μmol/L·min·mg。研究发现3种金属离子Zn~(2+),CO~(2+)和Cd~(2+)有利于酶蛋白结晶。结晶最佳条件是:采用112-34#试剂(0.05mol/L水合硫酸镉、0.1mol/L HEPS和1.0mol/L三水醋酸钠),蛋白质浓度为15 mg/ml,结晶温度为16℃,p H为7.5,结晶时间为30 d。腈水合酶蛋白单晶经X射线衍射,分辨率达到了3.7。该腈水合酶的纯化和结晶为进一步深入研究其结构和功能奠定了基础。     

化学衍生-溶剂结晶法从植物甾醇混合组分中分离豆甾醇

采用化学衍生和溶剂结晶法,建立起一条从植物甾醇混合组分分离豆甾醇的技术途径。通过对植物甾醇的乙酰化,溴化-脱溴和皂化反应,并结合相应试样的重结晶操作以分离豆甾醇。利用此方法从植物甾醇混合组分分离豆甾醇,其产率为6.9%,回收率45.7%,具有生物工业应用潜力。     

膜蛋白结晶方法学研究进展

膜蛋白执行着物质运输、能量转换和信号转导等重要生物学功能,其分子的三维结构解析对阐述其功能及开展理性药物设计有着十分重要的意义．目前膜蛋白结构解析以X射线单晶衍射技术为主,该技术需要高质量晶体作为衍射对象．然而由于膜蛋白具有两亲性,难以得到高度有序的三维晶体,进而导致其结构解析十分困难．针对此问题,研究者们发展了一些专门面向膜蛋白的结晶方法,如基于去垢剂的方法,基于脂类的方法等．本文回顾了这些方法,并对未来膜蛋白的结晶研究进行了展望．     

沙粒病毒聚合酶C端的表达纯化与结晶条件筛选 *

拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端负责结合宿主mRNA帽子。目前对哺乳动物沙粒病毒聚合酶C端的特征知之甚少。为此构建了拉沙病毒和马秋波病毒聚合酶C端的重组表达载体,并利用E.coli原核系统进行表达和后续纯化,获得了不同聚体形式的C端蛋白,通过分析超速离心实验和负染电镜观察对其不同的聚体形式进行了表征。最后通过大量筛选结晶条件,得到了拉沙病毒聚合酶C端的晶体,为进一步研究其三维结构和功能机制奠定了基础。     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。     

从废弃蛹虫草大米培养基中高效提取纯化虫草素工艺条件研究

虫草素是蛹虫草的次生代谢产物,具有重要的药用价值,当前主要从蛹虫草子实体中提取。本文提供了一种从蛹虫草子实体生产的副产物——大米培养基中高效提取纯化虫草素的新方法。该方法包括连续逆流提取、732阳离子交换树脂柱层析和结晶三步。对每一步的工艺参数进行了系统优化。用该优化的方法从大米培养基中提取虫草素,虫草素产品的纯度达98.0%以上,产率达66.0%以上。     

大熊猫、小熊猫和黑熊血红蛋白的组份分离、结晶及氨基酸组成分析

 聚丙烯酰胺凝胶电泳和羧甲基纤维素柱层析都表明大熊猫(Ailuropodmelanoleuca)、小熊猫(Ailurus fulgens)和黑熊(Selenarctos thibetanus)的血红蛋白各有两个组份。在近似的条件下得到了它们的晶体。三种动物血红蛋白的氨基酸组成相似,而且N-末端氨基酸都是Val。有待进一步测定全部氨基酸顺序,以揭示它们之间的异同和亲缘关系。