制备用于结晶的蛋白质样品

制备高质量蛋白质晶体是通过X射线衍射解析蛋白质分子三维结构的关键环节,是结构生物学领域中的瓶颈问题之一。蛋白质的结晶受多因素控制,其中蛋白质样品自身的质量是影响蛋白质能否结晶及晶体质量好坏的关键因素。我们从蛋白质纯度、可溶性、均一性及表面修饰等方面介绍了如何获得适于结晶的蛋白质样品,以及如何借助相关仪器检测蛋白质样品的质量,预测蛋白质的可结晶性。     

HD-8树脂分离天花粉中的L-瓜氨酸

本文研究了用HD8阳离子交换树脂从天花粉中分离L瓜氨酸的工艺条件。采用HD8阳离子交换树脂从天花粉水提取液中交换L瓜氨酸,该树脂对L瓜氨酸的静态交换容量为50.8mg·mL1。在流速为3BV·h1,提取液中L瓜氨酸浓度为9.64mg·mL1时,HD8树脂对L瓜氨酸的动态交换容量为46.8mg·mL1树脂,其动态平衡时间为12min。NH4OH洗脱HD8树脂载荷的L瓜氨酸效果好。控制洗脱液流速为5BV·h1,用8BV0.25mol·L1的NH4OH即可完全洗脱L瓜氨酸。采用HZ803大孔径吸附树脂吸附L瓜氨酸洗脱液中的色素,真空浓缩,并在pH=5.97、4℃条件下结晶L瓜氨酸,其收得率为7.24%,其中L瓜氨酸含量为82.7%。与等电点法相比,产品纯度提高2.36倍。     

八角茴香中莽草酸提取和纯化工艺的研究

本文对八角茴香中莽草酸的提取和纯化工艺进行优化研究.结果表明,莽草酸的最佳提取工艺条件为:常规水浸提,温度80℃,固液比1:15,提取时间100 min,莽草酸的提取量达到0.1795 g.最佳纯化工艺:莽草酸浸膏搅拌硅胶,柱层析,乙酸乙酯洗脱,莽草酸洗脱量达到0.1742 g,真空浓缩至干,甲醇和水混合结晶,得含量98%的纯品莽草酸.     

筛选蛋白质结晶条件的试剂盒研发进展

蛋白质结晶条件筛选是蛋白质分子三维结构解析的主要限速环节之一,因此发展筛选效率较高的结晶条件筛选试剂盒有着十分重要的意义.目前广泛应用的结晶条件筛选试剂盒的设计方法主要有不完全因子法、稀疏矩阵法和系统筛选法.结晶学家基于这三种方法研发了一系列用于蛋白质结晶条件筛选的试剂盒.评述了20世纪以来筛选试剂盒的设计方法及应用进展,并展望了其未来的发展方向.     

6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶的纯化与结晶条件

【目的】在大肠杆菌中克隆表达尼古丁降解关键的6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶基因hspB,纯化重组HspB蛋白并进行结晶条件的初步研究。【方法】从恶臭假单胞菌S16基因组中PCR扩增hspB基因,构建重组表达载体pET28a-hspB,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白。利用悬滴扩散法对HspB蛋白进行结晶条件筛选和优化。【结果】本文成功构建重组质粒pET28a-hspB并纯化获得达到结晶纯度的HspB蛋白。结晶条件初筛和优化后获得可培养HspB蛋白晶体的条件为0.2 mol/L NaCl、0.1 mol/L HEPES pH 7.5、1.1 mol/L(NH4)2SO4、4°C、加晶种。【结论】HspB蛋白纯化体系的构建和结晶条件的初步研究为从结构生物学的角度进一步研究HspB结构与功能的关系、定向进化提高HspB催化效率奠定了基础。     

氨基酸结晶与提纯工艺的探讨

本文针对氨基酸的结晶和提纯的实际发展现状进行了研究和分析,希望可以给相关人员提供参考。     

离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯代盐对溶菌酶结晶的影响

以亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐(BmimCl)为添加剂,研究离子液体对溶菌酶结晶的影响.分别考察了离子液体对溶菌酶晶体数量与尺寸、晶体形貌及蛋白质纯度的影响,并探讨了离子液体对结晶过程影响的作用机制.离子液体通过增大溶菌酶的溶解度和其自身低蒸气压两种途径,降低了溶菌酶在结晶过程中的过饱和度,更有利于晶体的成核和生长,得到更好的结果.如避免多晶态现象的发生,增大晶体的尺寸,降低溶菌酶样品纯度的要求.X-射线衍射分析表明,离子液体未改变晶体的晶型结构,但可提高晶体的衍射分辨率.     

耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB信号肽与β-FFase融合表达质粒pET22b-pelB-bff,将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白,采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒pET22b-pelB-bff,通过优化诱导表达条件,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度30 °C,诱导时间10 h,比活力高达108 U/mg,实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达,纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙,0.1 mol/L HEPES pH 6.7,26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1 ?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究,为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系,定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。     

辣椒疫霉PcCRN20-C蛋白的表达纯化及结晶 *

CRN(crinkling and necrosis-inducing protein)为疫霉菌在与寄主互作过程中分泌的一类特有胞质效应因子,干扰寄主细胞正常的生理代谢和功能。采用PCR法从辣椒疫霉LT1534菌株cDNA中克隆PcCRN20-C基因。该基因序列长783bp,编码261个氨基酸。构建重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。在优化条件下诱导表达重组蛋白,利用Ni-NTA金属螯合层析、离子交换层析、分子筛层析和胰蛋白酶酶解技术获得高纯目的蛋白,SDS-PAGE分析表明,蛋白质分子量约为25kDa。采用座滴气相扩散法进行晶体制备和筛选,成功获得了蛋白质晶体,并通过X-射线衍射仪收集了晶体衍射花样。结合蛋白质晶体学方法,获得了有衍射的辣椒疫霉PcCRN20-C蛋白晶体,为进一步研究CRN蛋白的结构与病原菌致病机制提供参考资料。