尿激酶催化结构域在毕氏酵母中的表达、纯化及结晶

利用重叠延伸PCR方法扩增尿激酶催化结构域的突变体基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,转化酵母X-33,用Zeocin筛选高拷贝数的酵母菌落.重组蛋白通过阳离子琼脂糖柱纯化,纯度达到99%,该仅含尿激酶催化结构域的突变体(C279A/N302Q),无需激活即具有尿激酶活性.用气相扩散法获得蛋白质晶体,其衍射分辨率达1.45!.     

比色法测定复合氨基酸注射液中的N-乙酰-L-半胱氨酸

根据Ｎ－乙酰－Ｌ－半胱氨酸与氯化钯（ＰｄＣｌ２）反应,生成一种稳定的黄色化合物,我们建立了比色测定复合结晶氨基酸注射液中的ＮＡＣ的方法。测定波长为３７５ｎｍ,检测结果重现性好,变异系数是３．９％,回收率范围在９３．１％～１００．２％之间,检测下限为０．１６３μｇ／ｍｌ。该方法比经典的电量滴定法灵敏度高、精确性好,较高压液相色谱法操作简便、费用低。     

分子生物学在蛋白质结晶中的应用

获得具有高分辨率的蛋白质晶体是目前蛋白质结构测定的主要瓶颈 . 蛋白质结晶受很多因素影响,蛋白质自身是结晶时最重要的变量,可以说,蛋白质的内在特性在某种程度上决定了其能否结晶以及所得晶体分辨率的高低 . 近年来分子生物学尤其是蛋白质工程的应用有效地提高蛋白质的溶解度、均一性及可结晶性等内在特性,促进蛋白质的结晶,成为提高蛋白质结晶能力和蛋白质晶体分辨率的有效途径 .     

重要虫生真菌莱氏野村菌芽生孢子的形态发生

经对比,萨氏麦芽糖-酵母浸粉培养液(SMY)较适合制备莱氏野村菌Nomuraea rileyi芽生孢子。以菌株Nr09接种该培养基,在130r/min、25℃全光照下震荡培养,观察芽生孢子在不同时期发育的形态变化。结果表明,分生孢子萌发产生芽管;24h萌发率为42%,36h时达84%。芽管迅速伸长形成菌丝。在48h前芽生孢子通过菌丝顶端及分枝末端缢缩的方式形成,后期则主要通过芽生孢子继续出芽的方式大量形成,78h芽生孢子数量达到最大值。芽生孢子的形成方式可为一端、两端或多端芽殖。芽生孢子的形成过程可分为5个阶段:(I)分生孢子膨大期;(II)芽管萌发期;(III)芽管延长期;(IV)芽生孢子形成初期;(V)芽生孢子指数生长期。30h后培养液中有少量草酸钙结晶出现并逐渐增多。到84h时有31%的芽生孢子细胞内液泡聚集增大,表明芽生孢子已开始进入衰老阶段。使用指数生长期制备的Nr09芽生孢子进行几丁质酶基因转化,转化效率达79个转化子/μgDNA。     

遗传信息传递的晶体学解密

生物大分子(如蛋白质等)在生物体内行使功能必须要保证其立体结构的正确性。作为研究大分子高级结构的主要手段,结晶技术结合X-射线衍射技术、核磁共振技术以及电镜技术被普遍应用于高级结构的数据分析。随着这些技术的进一步完善,目前已经能完成蛋白质与配体的共结晶。遗传信息从最原始的DNA或RNA传递到以蛋白质的形式呈现功能的过程是由众多酶或蛋白质复合体催化的多步骤进程,解析其中重要元件的空间结构推动了对这些酶反应机理的深入研究。主要阐述结晶技术在遗传信息传递过程中关键酶或蛋白质复合体的研究中的应用。     

PRRSV非结构蛋白Nsp2PL2域结构及其去泛素化酶功能

为了解PRRSV非结构蛋白Nsp2的PL2域结构及功能,本研究通过构建PL2、PL2融合Ub的Strep标签的原核表达质粒,表达获得纯度95%以上的蛋白,进行结晶。结果表明PRRSV PL2蛋白的聚集状态具有浓度依赖性,优化出短粗和长细两种晶型的蛋白晶体。通过细胞内外实验了解PL2的去泛素化酶特征。将纯化的Ub-PL2-Strep蛋白分别与K48、K63或KO(线性)泛素化的蛋白孵育,检测蛋白体外去泛素化酶活性;将构建的PL2真核表达载体与不同位点泛素质粒共转染以了解PL2去泛素化酶活性及作用模式。结果表明PL2蛋白具有去除K48、K63及线性泛素化修饰的广谱去泛素化酶作用。PL2蛋白高二硫键含量,多聚特性影响规则晶体及衍射图的形成。PL2蛋白结构及功能的研究为PRRSV致病机制及药物靶点的筛选提供了依据。     

嗜极微生物的多样性

嗜极微生物(extremophilicmicrobes)指的是极端条件下生存及繁衍的微生物,也称极端环境微生物。这个微生物世界的成员,有的能培养,从中获得培养物;有的则否,但它是客观存在的,通过间接的方法推断其存在。这些年来,人们较为熟悉的嗜极微生物有嗜碱微生物、嗜酸微生物、嗜高温微生物、嗜冷微生物、嗜盐微生物、嗜高压微生物;还有把抗辐射微生物、耐干旱微生物列为嗜极微生物。这充分表明,嗜极微生物生存于地球、宇宙间的多样性。就那些嗜盐微生物而言,也有它的多样性,丰富多彩。在美国,研究人员发现结晶盐中存在着微生物世界,也就是说,在大块…     

三种蛋白质生物素化化学方法的比较研究

本文以N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxy succinimide,NHS)活化酯偶联法原理为基础,探究结晶偶联法、反应液直接偶联法及二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)偶联法之间的优劣。旨在为实验室安全有效、快捷便利地进行蛋白质生物素化提供更优选择。分别用上述三种方法对牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)进行生物素偶联实验,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)以及紫外波谱扫描特征吸收峰鉴定偶联产物,用凝胶成像系统及Image Lab软件操作系统测定偶联产物相对分子质量,以此确定偶联比。结合上述定性、定量结果对三种偶联方法进行评价。结果显示,三种方法均可以将生物素偶联到BSA上。结晶偶联法首先通过化学合成活化酯并结晶,产率为37.28%,熔点为214～217,偶联比为8.9,单次反应成本128.71元;直接偶联法偶联比为7.0,单次反应成本34.01元;DCC偶联法偶联比为2.2,单次反应成本33.81元。综上可知,反应液直接偶联法相较于结...     

棕色固氮菌缺失nifE的突变种固氮酶钼铁蛋白的结晶

从限氨固氮培养基中培养棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii Lipmann)缺失nifE的突变种DJ35中,分离纯化得到缺失FeMoco的钼铁蛋白（△nifEAvl)。在一定条件下结晶得到深棕色短斜四棱柱晶体。结晶溶液中各组分的浓度以及结晶方法等对其晶核数目,晶体大小和质量有明显影响,目前用气相扩散的悬滴法所得的最大晶体的二维边长分别为0.12mm和0.13mm。     

粉褶蕈属—新亚属和一新种

本文描述了粉褶蕈属Entoloma1个具有被结晶囊状体的特殊新种,并为此建立了1个新亚属。新亚属为结晶囊粉褶蕈亚属Metuloidoentoloma,新种为结晶囊粉褶蕈Entoloma metuloideum。文中有上述新亚属及新种的拉丁文及英文描述。模式标本（HMIGD 18773）采于广东省南岭国家级自然保护区,保藏于广东省微生物研究所真菌标本室（HMIGD）内。