猪-C反应蛋白的分离纯化及其性质的研究

以猪血清为材料,通过磷酸乙醇胺—琼脂糖亲和层析,Sepharose 4B柱层析和Sephacryl—S300凝胶过滤,获得了猪C—反应蛋白的结晶。猪C—反应蛋白可与肺炎球菌壁C多糖发生特异的沉淀反应,这种结合是依赖钙离子的。EDTA和一些磷脂代谢产物如磷酸胆碱,磷酸乙醇胺等,能抑制猪C—反应蛋白与C多糖的结合。在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳中,猪C—反应蛋白表现出与人C—反应蛋白相同的行为,亚基是一条分子量为23.5kD的肽链,全分子的表观分子量为150kD。猪C—反应蛋白与兔抗人C—反应的蛋白的抗血清能发生免疫交叉反应。     

中等强度稳态磁场影响小分子结晶的初步探索

葡萄糖、钙和钠等生命所需基本物质在维持生物体生理机能,改变电势能和调控细胞和细胞器功能等多项生命活动中起着关键作用。细胞功能的实现很大程度上依赖于特定分子在一定浓度下的聚集和解聚,而越来越多的证据表明相分离过程可能参与其中。溶液结晶本身也是一种特殊的相分离,虽然磁场影响溶液结晶已有零星报道,但不同参数磁场对不同物质结晶的影响尚未有报道。本文使用2种不同强度的外加磁场（0.036 T、0.068 T）对葡萄糖、葡萄糖酸钙和氯化钠的结晶过程进行了初步探究。试验结果显示：虽然2种磁场对3种物质析出晶体的质量影响程度不同,但均有促进;从结晶数量上来讲,磁场对葡萄糖和葡萄糖酸钙也有促进,但对氯化钠无显著影响。虽然溶液蒸发量受不同强度磁场影响不同,但与溶液质量浓度成反比。根据结果可以推测,对于蒸发结晶过程来说,磁场可能通过对蒸发量和对带电粒子的影响共同调控结晶过程。本研究通过对磁场影响结晶过程的初步探究,不仅为进一步研究磁场生物学效应及机制提供了理论基础,也为工业生产中提高结晶效率提供了新的思路。     

效应蛋白LepB的表达,纯化及其亚克隆片段的结晶研究

为了研究嗜肺军团菌通过其效应蛋白发挥的致病机理,效应蛋白的结构和生物学功能研究是至关重要的。我们构建了效应蛋白LepB全长载体PFastBac1,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了全长LepB蛋白,并构建9个LepB亚克隆的原核表达载体PGEX-1,通过GST亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,纯化得到了纯度较高的蛋白片段。通过悬滴气相扩散法进行蛋白结晶筛选,获得了效应蛋白LepB片段480~679的蛋白晶体,为解析效应蛋白LepB的结构和生物学功能研究奠定基础。     

植物黄酮二氢杨梅素的提纯及结晶形态研究

显齿葡萄属植物富含黄酮物质。研究对显齿葡萄黄酮提取物二氢杨梅素的提纯及结晶态进行了初步探讨。结果表明:以水作为结晶溶剂进行多次重结晶,可有效去除植物黄酮提取物的杂质,总黄酮含量由原来的86%提高至96.5%。二氢杨梅素在水相中的结晶态多为针状结晶,水相保温结晶呈放射性棒状结晶。在pH4.5的条件下,其溶解度最低可获得较高的回收率。     

棕色固氮菌突变种UW45的固氮酶钼铁蛋白（NifB-Av1）结晶

经两次DE52和Sephacryl s一300柱层析,从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变利UW45粗提液(37 677mg蛋白)中纯化得到628 mg的NifB^-Av1。经考马斯亮蓝R-250染色的SDS凝胶电泳分析表明,该蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯,组成它的亚单位的种类与Av1(α和β亚单位)相似。NifB^-Av1不能与NifB^-Av2重组成具放氢活性的固氮酶,但可使与其保温重组的FeMoco显出高活性。在合适条件下,NifB^-Av1可在结晶溶液中析出棕色短斜四棱柱晶体,目前所得最大晶体的二维边长均为0．1mm。能否出现晶体以及出晶时间、晶体数目、大小、质量和形状等,与沉淀剂溶液各组分的种类和浓度、结晶方法、实验操作等因素密切相关。初步结果表明,所得晶体为NifB^-AV1单晶。     

高稳定人胰岛素的晶体学研究:Ⅲ,A21-Asp突变体的结晶和初步晶体学分析

研究一系列有明确意义改性胰岛素的结构将有益于新型胰岛素分子的设计。经蛋白质工程制备的AspA21—人胰岛素(ADHI)基本保持了生物活力,而在酸性溶夜(pH3—4)中的稳定性比天然胰岛素在中性溶液中高5—10倍。本文报道ADHI的结晶、初步晶体学研究及中等分辨率衍射数据的收集。ADHI晶体属R3空间群:a_H=b_H=82.72埃,c_H=34.02埃。     

5'-单磷酸腺苷在水和乙醇/水体系中的溶解度模型

以固-液平衡理论溶解度模型、适用于非理想体系的λh方程为理论基础,结合本实验结晶条件,采用静态法测定了5’-单磷酸核苷(5’-AMP)在纯水以及不同配比乙醇/水体系中的溶解度,建立了5’-AMP水和乙醇/水体系的结晶热力学模型。显示该体系属于缔合引起的非理想溶液,并计算水及乙醇/水体系的溶解热和结晶热,为5’-单磷酸腺苷的工业结晶生产提供了热力学数据。     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学研究

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素（ＢｍＫ５）进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃（淅川）;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃（常德）。对两个产地的晶体分别收集了２．１埃（淅川）和１．６２埃（常德）分辨率的衍射数据。     

以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。