TALENs介导MSTN基因突变山羊的制备及性能分析

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是一种骨骼肌生长发育的负调控因子,可以抑制成肌细胞的增殖,是动物品种改良的重要候选基因,该基因突变能够引起骨骼肌的广泛性增生与肥大,产生“双肌”症状,导致动物脂肪分化减少、肌肉含量增加,从而满足市场动物肉品质消费的需求。为了获得“双肌”表型的MSTN基因突变克隆山羊,本研究在山羊MSTN基因第一外显子序列设计并构建TALENs表达载体,转染山羊胎儿成纤维细胞,经嘌呤霉素筛选获得抗性细胞株,通过PCR检测和基因测序筛选MSTN基因突变细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植,并鉴定MSTN基因突变类型;通过组织切片分析MSTN基因突变山羊肌肉组织形态结构,监测不同月龄克隆山羊体重并分析其不同生长发育阶段的体重增长趋势。结果表明,共获得109株MSTN基因突变细胞株,突变效率达到79.0%(109/138),其中46株为双等位基因突变,占细胞株总数的33.3%(46/138)。选取4株生长状态较好的MSTN基因突变细胞株(1株为双等位基因纯合突变,3株为非纯合突变)进行体细胞核移植至12只受体山羊,30d时B超检查出受孕母羊4只,受孕率为33....     

盐酸酸化可改善核抗原免疫荧光染色

免疫荧光染色(immunofluorescent staining, IF)技术广泛用于细胞或组织内抗原定性、定量或定位检测。然而,依常规染色步骤操作,在有些胞核抗原的检测中很难得到令人满意的结果。有研究者采用盐酸酸化预处理用于细胞增殖标记物5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)的荧光染色并获得良好效果。但此方法是否也适用于其他类型的胞核抗原,尚不清楚。为系统全面分析盐酸酸化在胞核抗原免疫荧光染色中的作用,本文以成年C57BL小鼠主要嗅觉表皮(MOE)为材料,分别对Ki-67、5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)三种不同类型的胞核抗原进行盐酸酸化处理免疫荧光染色。结果显示,当血清封闭和抗体浓度等条件一致时,室温下盐酸酸化2 h,Ki-67的染色效果最佳,而阴性对照与未酸化组均未出现阳性信号;同样经过盐酸处理2 h,5mC和5hmC染色也呈现较强的阳性信号。该研究表明,在一些胞核抗原免疫荧光染色中,使用盐酸酸化处理可显著提高染色效果。     

细胞抽提物诱导的体细胞重编程

体细胞重编程是指在特定条件下将已分化的体细胞去分化逆转回原始多能状态或转分化为其他类型细胞。目前诱导体细胞重编程的方法主要有：体细胞核移植、细胞融合、特定转录因子转染、细胞抽提物诱导等。近年来抽提物诱导体细胞重编程越来越受到研究者的关注。利用此法, 通过重编程不仅可以获得需要类型的细胞, 而且方便识别与重编程有关的细胞因子, 探求重编程的机制。文章简略概述诱导体细胞重编程的方法, 并重点阐述细胞抽提物诱导体细胞重编程的研究进展。     

山羊M II期卵母细胞胞质支持异种间克隆胚的着床前发育

研究去核山羊(Capra hircus)体内成熟的M II期卵母细胞与异种成年的哺乳动物(包括山羊、波尔山羊、牛、塔尔羊、熊猫)及人的成纤维细胞融合形成的体细胞核移植胚胎着床前的发育能力。结果显示这些异种体细胞核移植重构胚可以完成着床前发育, 并形成囊胚。种内体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为78.67%(557/708)和56.29%(264/469); 亚种间或种间体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为: 波尔山羊78.18%(541/692)、33.90%(40/118), 牛70.53%(146/207)、22.52%(25/111), 塔尔羊53.51%(61/114)、5.26%(3/570), 熊猫79.82%(1159/1452)、8.35%(75/898), 人68.76%(317/461)、5.41%(16/296)。由此结果得出以下结论: (1)山羊M II期卵母细胞胞质与供核细胞之间的亲缘性不影响两者的融合率; (2)山羊M II期卵母细胞的胞质能支持异种间体细胞核移植胚的着床前发育; (3)亲缘关系近的种间核移植胚的囊胚发育率高于亲缘关系远的种间核移植胚的。     

苏云金芽孢杆菌Bt9875晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡

[目的]研究苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt9875菌株晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响.[方法]采用MTT比色、荧光显微观察、DNA凝胶电泳、流式细胞术等方法来检测不同浓度的Bt9875晶体蛋白处理后HL-60细胞的凋亡特征.[结果]Bt9875晶体蛋白对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用,且随着蛋白质浓度的增加对HL-60细胞生长抑制愈加明显,而对正常人外周血单个核细胞(PBMC)无作用;荧光显微镜下观察发现经该蛋白作用后HL-60细胞核的形态呈现凋亡特征;流式细胞术分析表明,HL-60细胞经100 μg/mL晶体蛋白作用后,凋亡率达到52%;琼脂糖凝胶电泳显示细胞DNA呈梯状降解.[结论]初步证明了Bt9875晶体蛋白在体外能够明显抑制HL-60细胞的增长,并诱导其凋亡,这为苏云金芽抱杆菌晶体蛋白的应用开创了新的思路.     

体细胞核移植与中心体遗传

体细胞克隆虽然在多种哺乳动物中成功获得后代, 但仍存在一系列的问题需要解决。克隆胚胎的发育能力由核移植后几小时内的细胞和分子过程决定, 包括染色体分离和纺锤体的重新组装。中心体的正常组成和分布能保证染色体分离的准确性及新生和出生后克隆动物发育过程中的基因组稳定性。文章在分析哺乳动物体细胞克隆存在的问题和简介中心体结构功能的基础上, 综述了中心体在配子和受精卵发育过程中的遗传机制, 同时阐述了体细胞克隆胚胎中心体及其相关蛋白的研究现状。     

广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期.利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部.其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪.说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔.     

活化的T细胞核内因子（NFAT）的调节及其在神经系统中的功能

活化的T细胞核内因子（nuclear factor of activated T-cells, NFAT）作为细胞信号转导通路中的一类重要的转录因子参与细胞功能的调节. NFAT的活化主要是通过细胞内钙/钙调神经磷酸酶（Ca2+/calcineurin）的刺激启动,它脱磷酸后发生核转位并与DNA的特定序列结合,同时通过与其它转录因子的协同作用,调节目的基因的特定表达. NFAT在免疫系统中所调节的基因表达已经得到了充分的研究. 近年实验研究发现,NFAT的转录因子家族在脊椎动物的神经系统中也发挥着非常重要的作用. 本文综述了NFAT家族蛋白的分类、结构、磷酸酶与激酶对其出入核的调节及在神经系统中的研究进展,使得能够更加全面地认识calcineurin/NFAT信号通路的作用. 此外,由于环孢菌素A（cyclosporin A）等药物在神经系统应用的局限性,对于NFAT调节深入研究,也将为筛选或者开发更为高效、低毒药物提供新的思路.     

人-兔异种核移植构建克隆胚的实验研究

“治疗性克隆”是人类最关注的课题之一,而人体细胞核移植是治疗性克隆的基础和前提。异种核移植的方法虽已被引入人体细胞克隆胚的构建,但供体细胞的类型、培养代数及准备方法与其效率之间的关系尚有待探讨。本实验以不同培养代数和不同准备方法的人卵丘细胞、皮肤成纤维细胞和软骨细胞为供体构建了克隆胚,对其发育情况的比较表明,以卵丘细胞为供体时重构胚的体外发育率高于其余二者,差异显著（P〈0．05）;不同培养代数的成纤维细胞克隆胚和不同冷藏天数供体细胞克隆胚体外发育率无明显差异。此外,本实验还尝试用荧光原位杂交法检测所构建的异种克隆胚核遗传物质的来源,结果显示来自人体细胞。本研究表明,人一兔异种核移植构建克隆胚切实可行;体细胞的类型与核移植效率相关;供体细胞的体外培养传代对克隆胚的发育并无影响;而冷藏是一种简便有效的供体细胞准备方法;此外,用FISH方法对重构胚进行核遗传物质的鉴定切实可行。     

博尔纳病病毒持续感染细胞系中病毒RNA的原位PCR检测

目的建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的原位PCR方法。方法首先设计BDV特异性引物以及检测BDV-RNA的原位PCR扩增系统．然后对BDV持续感染细胞(BDV／OL)和正常细胞(OL细胞)爬片进行原位PCR扩增,进而分别用DNA酶或RNA酶消化处理BDV／OL细胞爬片后,再进行原位PCR扩增。结果经原位PCR扩增后．约60％～70％的BDV持续感染细胞核中出现了阳性反应信号,但正常细胞无信号出现,并且病毒感染细胞中的阳性信号在RNA酶消化作用下消失,但不受DNA酶作用的影响。结论该研究建立的PCR检测方法具有BDV和RNA特异性,可以应用于检测相关动物或神经精神疾病患者的脑组织中BDV-RNA,为进一步证明BDV的致病性奠定基础。