草木樨状黄芪变异系中甲硫氨酸代谢相关cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用mRNA差异显示技术(differential display)从草木樨状黄芪耐甲硫氨酸变异系中分离到一差异cDNA片段,命名为tm03(360bp)。mRNA杂交结果显示,该片段只在变异苗中表达,初步确定其与甲硫氨酸代谢相关。测序后在Genebank搜寻,未发现有同源序列。进一步分析表明,该cDNA克隆可编码完整的蛋白。在该基因片段两端分别合成含HindⅡ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pRSET A表达载体,转化宿主菌JMl09(DE3),经IPTG诱导表达了N′端含6个组氨酸的蛋白质,分子量约为14kD,为进一步研究该蛋白的结构和生物学功能奠定基础。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

XBP-1转录激活系统的构建

人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB／ATF(cAMP应答元件结合蛋白／激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Westem印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-IS的活性约是空载体的3倍。成功构建了xBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBp-1在各种疾病中的作用奠定了基础。     

淀粉分支酶sbeIIb基因RNA干涉片段转化玉米自交系的研究

玉米高直链淀粉育种是玉米分子育种的一个重要研究方向.本实验中,首先研究了不同诱导愈伤培养基对再生体系的影响,确定了LS+2,4-D 2.0 mg/L+L-pro 700 mg/L+CH 500 mg/L+3 %蔗糖为诱导培养基.同时,构建并验证了含有淀粉分支酶sbeIIb基因双干涉片段载体和胚乳特异性启动子的表达载体pCAMBIA 1301+Glu+1620,并转入根癌农杆菌EHA105,以农杆菌转化法转化玉米自交系178.通过PCR检测,5株转化株表现阳性,初步证明了干涉片段已整合入玉米基因组中.     

蜘蛛杀虫肽基因的合成及其在植物中表达质粒的构建

近年来用生物制剂防治害虫,虽然可以避免环境污染,但效果往往不稳定,而用基因工程方法,将抗虫基因导入植物的基因组中,让植物自身产生抗虫物质,将是一种理想的途径［１,２］。抗虫的植物基因工程主要是利用苏云金杆菌的内毒素蛋白,转化此基因的烟草和番茄显示了对虫的抗性［３—６］。澳大利亚Ｄｅａｋｉｎ大学从一种蜘蛛毒液中分离纯化到一种只有３７个氨基酸的小肽,体外实验发现其能杀死多种对农业生产有害的昆虫,但对哺乳动物没有毒害作用［７］。我们根据此肽的氨基酸序列,采用植物偏爱的密码子,人工合成并克隆了此肽的基因…     

Promoting human embryonic stem cell renewal or differentiation by modulating Wnt signal and culture conditions

We previously showed that Wnt3a could stimulate human embryonic stem （hES） cell proliferation and affect cell fate determination. In the absence of feeder cell--derived factors, hES cells cultured under a feeder-free condition survived and proliferated poorly. Adding recombinant Wnt3a in the absence of feeder cell derived-factors stimulated hES cell proliferation but also differentiation. In the present study, we further extended our analysis to other Wnt ligands such as Wntl and Wnt5a. While Wntl displayed a similar effect on hES cells as Wnt3a, Wnt5a had little effect in this system. Wnt3a and Wntl enhanced proliferation of undifferentiated hES cells when feeder-derived self-renewal factors and bFGF are also present. To explore the possibility to promote the proliferation of undifferentiated hES cells by activating the Wnt signaling, we overexpressed Wnt3a or Wntl gene in immortalized human adult fibroblast （HAFi） cells that are superior in supporting long-term growth of undifferentiated hES cells than primary mouse embryonic fibroblasts. HAFi cells with or without a Wnt tmnsgene can be propagated indefinitely. Over-expression of the Wnt3a gene significantly enhanced the ability of HAFi feeder cells to support the undifferentiated growth of 3 different hES cell lines we tested. Co-expression of three commonly-used drug selection genes in Wnt3a-overpressing HAFi cells further enabled us to select rare hES clones after stable transfection or transduction. These immortalized engineered feeder cells （W3R） that co-express growth-promoting genes such as Wnt3a and three drug selection genes should empower us to efficiently make genetic modified hES cell lines for basic and translational research.     

一个新型耐热普鲁兰酶的结构与功能

新型普鲁兰酶的研究对于普鲁兰酶制剂的国产化、打破国外垄断具有非常重要的意义。从我国云南腾冲地区轮马热泉的淤泥中分离获得了一株耐热普鲁兰酶产生菌LM 18-11,经16S rDNA序列系统进化树分析,确定该菌为厌氧芽胞杆菌Anoxybacillus属种,并从中克隆获得了耐热普鲁兰酶的编码基因,该酶在55℃-60℃、pH 5.6-6.4的范围内具有最大的反应活性。此外,该酶具有较好的热稳定性,在60℃下处理48 h,仍可保持50%以上的活力;动力学分析该酶的Vmax和Km分别为750 U/mg和1.47 mg/mL,是目前文献报道中比活力最高的耐热普鲁兰酶。同时还对该酶进行了晶体结构分析,结果显示该酶具有?-淀粉酶家族中典型的结构,在N端具有一个特殊的底物结合域,该结构域的缺失导致比活力和底物结合力都有相应降低,Vmax和Km分别为324 U/mg和1.95 mg/mL。同时,将该普鲁兰酶编码基因导入枯草芽胞杆菌中,在P43启动子的控制下,普鲁兰酶基因获得了高效表达,胞外酶活可达42 U/mL,相比初始菌种,表达活力提高40倍以上。研究表明该普鲁兰酶具有很好的应用前景。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pY_α ,构建了中间质粒pY_α_gB。然后以中间质粒pY_α_gB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hsp_α_gB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达质粒pR_α_gB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 (pR_α_gB)的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击     

弱光照和富营养对苦草生长的影响

本研究通过比较在不同光照和营养(3光照×3营养)水平下栽培的沉水植物苦草(Vallisneria natans L.)的生长及生化指标,探讨了富营养水体中弱光和高营养对苦草生长的影响.结果表明:弱光对苦草生长的抑制作用不受外源营养浓度的影响;而高营养对苦草生长的影响受到弱光胁迫程度的交互作用,表现为在光照较强的45%日光下为抑制作用,光照最弱的2.5%日光下为促进作用,在光强居间的10%日光下没有明显作用.植物组织总氮、总磷、氨态氮及游离氨基酸氮含量随光照减弱而增加,而可溶性总糖和淀粉含量减少;总磷、氨态氮、游离氨基酸氮及淀粉含量随营养增加而增加.因此弱光照和过高营养均对苦草生长产生明显抑制作用,两者具有交互作用,主要表现为弱光影响了高营养的抑制作用.在本研究中,高营养对苦草生长有抑制作用,但尚不能导致铵中毒或储存碳缺乏;可能由于10%和2.5%日光下,弱光胁迫对苦草的代谢已产生很大抑制作用,限制了高营养对苦草的抑制作用.     

蛇伤致局部组织坏死的机理和防治研究现况

蛇伤引起的局部组织坏死是血循毒和混合毒类毒蛇咬伤后的一个严重并发症 ,其发生率高 ,临床处理棘手 ,伤口往往形成经久难愈的溃疡 ,许多患者还造成肢体残障。面对这样的难题 ,许多专家和临床工作者做了大量的研究和探索 ,提出了很多论点和方法 ,本文拟就文献中有代表性的成果和观点综述如下。1　蛇伤致局部组织坏死的机理　　毒蛇咬伤所致的局部组织坏死是由蛇毒中的肌肉毒素 (又称肌溶毒素、膜毒素、细胞毒素、心脏毒素、直接溶血因子等 )、响尾蛇胺及其类似物、蛋白水解酶和磷脂酶 A2 (PLA2 )对组织细胞结构(主要是膜性结构、特别是细…