创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定

目的 克隆创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）溶细胞素基因（υυhA）,构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性.方法 采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长υυhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列.采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E coli BL21（DE3）宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性.结果 所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%.在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%.提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带.重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体.结论 该研究成功地构建了创伤弧菌υυhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原.     

黑曲霉中内切菊粉酶基因及其全合成基因在解脂耶氏酵母中表达的比较

利用酵母密码子偏爱性将黑曲霉(Aspergillus niger)中的内切菊粉酶(Endoinu linase)基因通过基因全合成的方式合成为酵母密码子偏爱性的内切菊粉酶基因。然后将原始和全合成的内切菊粉酶基因克隆到解脂耶氏酵母表达载体PINA1296上,得重组解脂耶氏酵母表达载体pHBM2020、pHBM2021,将两种质粒分别转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB725,筛选得到重组解脂耶氏酵母CLIB725(pHBM2020)、CLIB725(pHBM2021),将两种重组酵母摇瓶培养,经SDS-PAGE、测酶活检测表明两种基因在解脂耶氏酵母中都有表达,全合成菊粉酶比原始菊粉酶酶活要高。     

骨桥蛋白与生殖

骨桥蛋白是细胞外基质的重要成分,它含有RGD序列,其主要受体为整合素αVβ3,二者相互作用共同参与介导细胞的聚集、黏附、增殖和迁移及免疫调节一系列重要过程.研究发现子宫内膜腺上皮细胞表达骨桥蛋白和其受体整合素αVβ3,且其在子宫内膜种植窗口期分泌至宫腔,推测与内膜容受性的建立及受精卵的种植有关.     

油菜素内酯对毛豆幼苗生长及其抗渍性的影响

试验采用不同浓度油菜素内酯对毛豆幼苗进行叶面喷施处理,测定其在渍水胁迫下对毛豆营养生长和生理特性的影响。结果表明:采用一定浓度的油菜素内酯处理可以促进苗生长、提高根系活力、叶绿素含量、脯氨酸含量和抑制丙二醛增生、降低细胞膜透性,增强了毛豆幼苗对渍水环境的抵抗能力。从叶面喷施后对毛豆的营养指标和生理指标进行综合判断可知:在试验的范围内,以1mL/L油菜素内酯的处理效果为最佳。     

克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略

能够生产有功用的治疗性蛋白的一个重要前提是获得稳定的重组蛋白高表达细胞株,然而筛选一个能够持续稳定表达外源蛋白的重组细胞株是费时费力的过程。有多篇文献报道了重组蛋白细胞株表达的不稳定性。位置效应是高表达细胞株不稳定性的重要因素,克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径。为解决外源基因插入的随机性所带来的不可预知的后果,可以事先在CHO细胞基因组中筛选转录热点区域,再通过位点特异性或同源重组的方式,实现外源基因的定点整合。各种调节位置效应的DNA元件陆续被发现,可以利用它们去调控基因表达及增加细胞株的稳定性。     

猪干扰素-α基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:克隆与分析猪干扰素-α(INF-α)基因,构建猪干扰素基因的高效植物表达载体。方法:根据NCBI中DQ248997序列设计引物,以猪的总DNA为模板,PCR扩增出猪的INF-α基因,克隆至pBS-T载体后进行序列分析,构建猪干扰素基因的植物表达载体。结果:实验所克隆序列经Blastn比对,98%的核酸序列相同,98%的蛋白质序列相同,3个非功能性氨基酸与基因库中序列不一致,推测为猪INF-α的一个亚型。构建的2个植物表达载体经BamHⅠ/SacⅠ限制性内切酶消化,均可得到570bp的目的基因。结论:成功克隆了猪的INF-α基因,并构建出含猪INF-α基因的高效植物表达载体pBI121/INF和pCAMBIA1301/INF。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

“十一五”期间生物产业重点领域发展思路研究

生物产业具有显著的技术推动和需求拉动双重驱动特性,科学技术研究为生物技术产业化提供可能性,而市场需求则将这一可能性转化为可行性。党的十六届五中全会《建议》指出,生物产业要充分发挥我国特有的资源优势和技术优势,面向健康、农业、环保、能源和材料等领域的重大需求,努力实现关键技术和重要产品研制的新突破。这一要求为培育和加速发展我国生物技术产业指明了方向和重点。     

美洲黑杨次生维管组织发育的内在节律性与细胞内含物的动态变化

美洲黑杨(Populus deltoids)是一种重要的商业用材树种, 在我国多用作胶合板和纸浆原料, 其速生性的特点也很早为人们所认识。众所周知, 树木次生维管组织的发育具有内在的节律性, 与此同时维管组织的细胞内含物也会发生动态变化。利用电镜技术及细胞化学方法, 研究了美洲黑杨次生维管组织的发育以及细胞内含物分布的变化, 发现次生维管组织的发育具有内在节律性, 在年周期中表现为分化期和休眠期交替出现; 次生韧皮部与次生木质部交替分化形成。在维管组织发育过程中, 早期蛋白质和脂类物质首先减少, 然后淀粉粒解体消失, 发育期内维管组织的蛋白质、脂类和淀粉的积累最少, 休眠期内维管组织细胞内最早出现淀粉的积累, 然后蛋白质和脂类物质积累大大增加。杨树维管组织发育过程的内在节律性与细胞内含物的动态变化密切相关。     

盛花期抗虫杂交棉及其亲本叶片基因表达差异与杂种优势

采用DDRT-PCR技术,以棉花盛花期项尖叶片cDNA为材料,对上海生物工程公司合成的专用于基因差异显示分析的3个锚定引物和全套26个随机引物进行筛选,最后选择了15个扩增差异带丰富的随机引物。采用3个锚定引物和这15个随机引物组成的45对引物组合对24个抗虫棉杂交组合及其10亲本盛花期叶片cDNA进行扩增和差显,2次扩增重复率达70．1％,表明在扩增过程中存在较高的假阳性,通过重复PCR扩增,统计稳定扩增的条带,可减少假阳性干扰。根据基因表达方式,将其划分5种模式：MI为双亲表达沉默,双亲出现条带而杂种没有条带;M2为单亲表达沉默,带仅出现在亲本之一,包括仅母本有带而父本和杂种无带和仅父本有带而母本和杂种无带2种表达方式：M3为杂种特异表达,带仅出现在杂种,双亲无带;M4为单亲表达一致,带在双亲之一和杂种中出现,而在另一亲本中不出现,包括母本、杂种中有带而父本无带和父本、杂种中有带而母本无带2种方式;M5为基因表达一致,带在双亲和杂种中均出现。差显表达模式比例与产量性状和杂种优势分析表明：M4与所有产量性状均呈正相关,并且与单位面积铃数相关达显著水平,其他各种模式与杂种产量性状表型值均未达到显著水平;M2与单位面积铃数杂种优势呈显著负相关,M3与皮棉产量杂种优势呈显著正相关。上述结果表明,盛花期叶片中的基因显性表达和杂种特异表达有利于产量形成和杂种优势发挥。