含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含P_R启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）、重组人白细胞介素-3（hIL-3）和抗溶菌酶（HEL）抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36％以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对P_R启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以P_R、P_L或P_RP_L作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用P_R或P_L启动子可获得与使用P_RP_L串联启动子一样的高效表达.     

斑马鱼charon基因的克隆、抗体制备及分析

斑马鱼charon基因位于1号染色体上,其成熟肽编码区含有731 bp,编码243个氨基酸.charon基因编码Cerberus/Dan家族的一种分泌因子,它与心脏的左右不对称发育有关.为进一步研究charon在心脏左右不对称发育中的功能,以斑马鱼为动物模型,利用RT-PCR的方法成功克隆了斑马鱼charon基因片段,...     

布氏鲳鲹GHRH基因克隆、组织和胚胎表达模式

促生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)主要生物学功能是刺激垂体细胞分泌生长激素,已被证实是动物体生长轴的重要调控因子之一,布氏鲳鲹是一种生长快速的海洋鱼类,为了揭示其代谢旺盛的调节机制,本研究从GHRH入手,利用RACE技术和qPCR方法对布氏鲳鲹GHRH基因进行了克隆、组织和胚胎表达模式研究。实验结果显示,布氏鲳鲹GHRH基因cDNA序列全长1019bp,5’UTR、3’UTR长度分别为327 bp和164 bp,开放阅读框528 bp,共编码175个氨基酸;同源性分析结果表明,布氏鲳鲹GHRH基因与其它鲈形目鱼类的同源性在91%以上。布氏鲳鲹GHRH基因的表达区域大多都集中在中枢系统,其中下丘脑表达量最高;GHRH在受精卵期到后续发育过程中均检测到表达,其表达水平在仔鱼期达到最高。序列分析、组织及胚胎表达的结果表明,布氏鲳鲹GHRH的调节模式仍然可能通过下丘脑调节垂体释放GH,GHRH在个体发育的较早阶段即开始发挥作用。本研究掌握了布氏鲳鲹GHRH基因的基本规律,为进一步研究生长轴的调控提供了理论参考。     

金属离子胁迫对Sphingomonas sp. Y2降解壬基酚聚氧乙烯醚特性的影响

壬基酚聚氧乙烯醚（NEPOs）是全球应用量最大的非离子型表面活性剂之一,具有环境雌激素毒性。NPEOs的中间代谢产物种类多、难降解,且毒性远高于其母系化合物。为研究金属离子对功能微生物Sphingomonas sp. Y2降解NPEOs特性的影响,分析了金属离子的最低抑制浓度（MIC）、细菌形态、NPEOs降解效率及代谢产物组成等变化。结果显示,菌株Y2对多种金属离子具有耐受性,在重金属培养基中对Mn²⁺、Zn²⁺具有较高的耐受性,MIC分别为500、90 mg/L;在500 mg/L Mn²⁺胁迫下,菌株Y2对NPEOs降解率为100.00%（3 d）;在90 mg/L Zn²⁺胁迫下,菌株Y2对NPEOs的降解率为20.62%（5 d）;两种离子双重胁迫下NPEOs降解率为15.65%（5 d）;Mn²⁺胁迫下菌株Y2细胞表面结构和形态发生明显变化,且改变了NPEOs代谢产物中组分的含量组成,其中短链NPEOs与短链壬基酚聚氧乙烯酸（NPECs）的比例为0.68,与对照相比,抑制/减缓了短链NPEOs的羧化反应。结果表明,菌株Sphingomonas sp. Y2对多种金属离子具有耐受性,Mn²⁺胁迫对细胞表面超微结构及NPEOs中间代谢产物组分组成产生显著影响。该研究将为表面活性剂类污染物的生物降解及相应代谢产物在环境中的毒性评价提供理论依据。     

重组小鼠IL-38蛋白制备及其生物学活性分析

制备小鼠IL-38蛋白,并检验其生物学活性。对IL-38的基因进行密码子优化并化学合成优化后的基因,将其插入原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-IL-38质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍亲和层析法纯化制备IL-38蛋白;分别用IL-36γ和IL-38干预小鼠肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)细胞,ELISA检测各组Th1细胞因子的分泌水平。经SDS-PAGE分析获得纯度高达95%的IL-38蛋白。相对于对照组,IL-38处理组Th1细胞因子分泌水平明显降低(P0.05)。成功制备小鼠IL-38蛋白,证实了IL-38对IL-36γ刺激的MLN细胞炎性反应具有负向调控作用,为进一步研究IL-38在炎症性疾病中的免疫调节功能提供参考。     

B型酪氨酸激酶受体的轴浆转运

脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在发育及成熟的中枢神经系统(central nervoussystem,CNS)中起到举足轻重的调节作用,而其中绝大部分作用由其B型酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptortype B,TrkB)介导,因此TrkB在神经元中的轴浆转运过程显得尤为重要。本文从动力蛋白、潜在调节分子、细胞骨架蛋白等方面对TrkB轴浆转运分子机制的研究进展进行综述,并就其进一步研究提出一系列的问题与展望。     

猪霍乱沙门氏菌递送的双启动子表达载体的构建

猪霍乱沙门氏菌C500株不仅可以作为预防猪沙门氏菌病的活疫苗,还可作为运送其他DNA疫苗的优良载体,并通过粘膜免疫诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。为增强其携带的DNA疫苗的免疫效力,本研究以真核表达载体pEGFP-C1为基础,将其真核启动子CMVie与原核启动子Ptrc串联,并在其多克隆位点MCS下游引入rrnbT1T2转录终止序列,构建了真、原核双启动子表达载体pEGFPPtrcR。用1×TSS法将其转化C500,得到工程菌C500/pEGFPPtrcR,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了报告基因EGFP的原核表达,该菌在荧光显微镜下能发出强烈绿色荧光,被证明在体外至少能稳定遗传20代;采用脂质体介导法将pEGFPPtrcR转染Vero细胞,EGFP在胞核和胞浆内表达,24h后观察可到明显绿色荧光。结果表明,双启动子表达载体pEGFPPtrcR构建成功,预示其携带的外源基因既可在C500中表达,又可在体细胞中表达,为研制以C500为载体的新型DNA疫苗的发展开辟了一个新的途径。     

序列特异的三锌指多肽的构建及其在大肠杆菌中的表达

在获得单一锌指突变体的基础上,以小鼠转录因子Zif268的三锌指DNA结合区为模板,利用重叠(Over-lap)PCR技术,获得了关键氨基酸位点同时突变的三锌指突变体ZF123、2ZF123。ZF123、2ZF123分别克隆进pUC-18质粒,序列测定正确后,以pGEX-2T为表达质粒,在大肠杆菌JM109中实现了功能性的表达。经SDS-PAGE分析,表达出了分子量34.0kD的融合蛋白,扫描分析其含量在20%左右。菌体经超声波破碎后,对可溶性融合蛋白进行了纯化得到了游离的目的蛋白,为进一步的DNA结合特性分析、杂交转录因子的构建等奠定了基础。     

慢性肺源性心脏病患者血清白细胞介素-6、降钙素原、D-二聚体、N端B型脑钠肽前体与心功能分级和预后的关系研究

摘要 目的：探讨慢性肺源性心脏病（CCP）患者血清白细胞介素-6（IL-6）、降钙素原（PCT）、D-二聚体（D-D）、N端B型脑钠肽前体（NT-proBNP）与心功能分级和预后的关系。方法：选取2020年1月～2021年5月合肥市第一人民医院全科医学科及呼吸与危重症科收治的170例CCP患者（CCP组）,其中纽约心脏协会（NYHA）心功能分级Ⅱ级49例、Ⅲ级66例、Ⅳ级55例,根据1年后存活状况分为死亡组26例和存活组144例,另选取同期54名体检健康者（对照组）。收集CCP患者临床资料,采用酶联免疫吸附法检测血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平。通过多因素Logistic回归分析CCP患者预后不良的影响因素,受试者工作特征（ROC）曲线分析血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平对CCP患者预后不良的预测价值。结果：与对照组比较,CCP组血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平升高（P＜0.05）。Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CCP患者血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平依次升高（P＜0.05）。单因素分析显示,死亡组NYHA心功能分级Ⅳ级、肺动脉收缩压、Tie指数和血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平高于存活组,第1秒用力呼气容积（FEV₁）占预计值％、FEV₁/用力肺活量（FVC）、三尖瓣环收缩期位移低于存活组（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示,NYHA心功能分级Ⅳ级和肺动脉收缩压、IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP升高为CCP患者预后不良的独立危险因素,FEV1占预计值％升高为独立保护因素（P＜0.05）。ROC曲线分析显示,血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平单独与联合预测CCP患者预后不良的曲线下面积分别为0.789、0.789、0.792、0.801、0.954,灵敏度分别为93.33％、66.67％、66.67％、86.67％、86.67％,特异度分别为46.67％、82.67％、85.33％、66.67％、94.67％。血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平联合预测CCP患者预后不良的AUC大于单项预测（P＜0.05）。结论：CCP患者血清IL-6、PCT、D-D、NT-proBNP水平升高可增加心功能严重程度并导致预后不良,可作为CCP患者预后不良的辅助预测指标,且四项指标联合检测具有更好的预测效能。     

嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶的异源表达及酶学性质研究

运用生物信息学技术从嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) CICC 20156中克隆获得羧酸酯酶基因,构建黑曲霉和毕氏酵母表达质粒,将重组质粒分别转化毕氏酵母GS115和黑曲霉pyrG基因缺陷株M54．SDS-PAGE和Western blot检测显示：携带His标记的外源蛋白在转化真菌宿主中均获得了高效分泌性表达,毕氏酵母和黑曲霉表达的外源蛋白分子质量均约为29 ku,蛋白质浓度分别为30.7 mg/L和15.3 mg/L．生物学活性测定表明,毕氏酵母与黑曲霉表达的羧酸酯酶单位蛋白酶活分别为22 671 U/mg和21 438 U/mg．酶学性质研究显示,两种表达系统表达的重组羧酸酯酶的酶学特性基本一致,它们在40～70℃范围内均显示较好的酶活性,最适反应温度为60℃．70℃处理30 min,毕氏酵母和黑曲霉表达重组羧酸酯酶残余酶活分别为 76.7%和67.6%,显示出良好的热稳定性．在pH 6.5～8.5的范围内显示较高酶活性,最适pH为8.0．上述研究首次实现了具有良好热稳定性的嗜热脂肪芽孢杆菌羧酸酯酶在黑曲霉和毕氏酵母中高效异源分泌性表达,其中毕氏酵母羧酸酯酶的产量要高于黑曲霉的酶产量,但考虑到重组黑曲霉表达外源性蛋白无需使用任何诱导剂,黑曲霉菌表达热稳定性羧酸酯酶可能具有更好的应用前景．