莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。     

大马勃水溶性多糖的结构研究

采用热水浸提,乙醇沉淀的方法得到大马勃粗多糖,经Sevag法脱蛋白,DEAE—sepharose fast flow离子交换层析及sephacrylS-300HR凝胶过滤法得大马勃多糖（CGPI-1）。气相色谱研究表明,其单糖组成为：Gal,Glc,Man等四种单糖,其中Gal,Glc,Man,摩尔比为3．92：11．28：1．22。经部分酸水解,红外光谱及核磁共振光谱,高碘酸氧化,Smith降解等分析,CGPI-1的主链由Man和Glc构成,存在β型和α型两种糖苷键构型,支链或主链的末端残基由β-Gal（1→4）,β-Glc（1→6）,α—Glc（1→4）构成,其分子中存在酰胺结构。原子力显微镜观察发现CGPI-1呈分支的线性分子,在水溶液中容易互相缠绕形成强大的网络结构。     

鲫鱼血清凝集素的生物学性质研究

采用硫酸铵盐析和梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,从鲫鱼血清中分离出一种天然凝集素,对其生物学性质进行研究。结果表明,该凝集素能够识别和凝集多种细菌,红细胞和酵母,不被透析,耐热,耐碱,抗DNase,RNase,SDS,对胰蛋白酶,糖苷酶和β-巯基乙醇敏感等特性,是一种分子量为67kD,等电点为6.2的糖蛋白分子,其活性能被乳糖、半乳糖,甘露糖和重金属离子所抑制,能显著促进巨噬细胞的吞噬,杀菌能力,是一种重要的免疫调节分子。     

细胞生长因子的研究进展

以细胞生长刺激因子为重点,对细胞因子的来源、分离、纯化和鉴定进行了综述。     

从凝胶中回收DNA的一种简便方法

从凝胶中回收DNA的方法已见多种报道,其中的电洗脱法较实用,已有几种装置作为商品出售。Wu等的方法无须任何专门设备,而是在DNA电泳区带前方挖槽,槽内嵌半透膜,使样品自凝胶泳入槽内的缓冲液中。该方法说来简单,实际操作却很费劲,尤其在样品数量大或重复操作时,更觉不便。我们按照Wu等的工作原理,制成一种电洗脱器,可使DNA的回收操作变得简单而高效。     

铜藻岩藻黄素提取及纯化工艺研究

为了对岩藻黄素的提取、纯化进行系统研究,进而为高纯度岩藻黄素的工业化生产提供研究基础,筛选了适用于提取铜藻（Sargassum horneri）鲜藻中岩藻黄素的有机溶剂,并通过单因素实验和正交实验确定了最佳的提取溶剂浓度、提取温度、提取时间、料液比等工艺参数。随后采用硅胶柱层析法进行纯化,并通过单因素实验确定了最佳的硅胶柱床高度、上样量和洗脱流速。最后采用制备液相法对经层析纯化的岩藻黄素进一步纯化。结果表明,有机溶剂萃取的最佳工艺条件为：甲醇浓度90%,提取温度50 ℃,提取时间1 h,料液比1∶10,此条件下岩藻黄素提取率达到(0.258 9±0.003 6) mg·g-1鲜重（FW）［(1.078 8±0.015 0) mg·g-1干重（DW）］。硅胶柱层析的最佳工艺条件为：硅胶柱床高度10 cm,上样量6 g,洗脱流速10 mL·min-1,此条件下岩藻黄素得率为0.176 5 mg·g-1FW（0.735 3 mg·g-1 DW）,纯度为87.01%±0.88%。经制备液相进一步纯化后,岩藻黄素得率为0.127 1 mg·g-1 FW（0.529 4 mg·g-1 DW）,纯度为99.27%±0.22%。研究所用工艺简单,岩藻黄素得率高,为高纯度岩藻黄素的制备提供了实验基础。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

褐飞虱细胞色素P450基因CYP4C62的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框（不含信号肽编码序列部分）,在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白。将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体。采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD。间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000。Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础。     

一种新型的琼脂糖疏水层析介质开发及其在重组乙肝表面抗原(CHO-HBsAg)分离纯化中的应用

以粒径均一的国产高交联度快速流琼脂糖为基质,采用活化、交联等步骤合成了针对分离纯化CHO-HBsAg的3C间臂的丁基琼脂糖疏水介质,通过控制丁基配基密度提高分离HBsAg的纯化倍数和回收率,获得了纯化倍数约20、HBsAg回收率约80%的介质。评估了合成介质的理化性质,流速为500cm/h时柱压力小于0.06MPa,表明介质具有较高的机械强度和良好的流动性能,介质经过酸、碱、变性剂等处理后化学性质稳定。将介质合成工艺进一步放大到2L介质/批,应用到HBsAg分离纯化的三步层析整和工艺中,结果表明,批量合成的疏水介质,HBsAg回收率与进口介质相当,HBsAg终产品纯度在95%以上,符合国家药典要求。最后考察了介质合成批次间的配基密度的可控性和单批次合成介质的重复使用性,结果表明,合成工艺和介质的重复性能满足产业化要求,这种成本低的介质有望替代目前工业生产广泛使用的进口疏水介质。     

生物法处理木质素的研究进展

对生物法处理木质素进行了简要概述,包括微生物降解、生物法酸析提取木质素以及生物法纯化木质素的效果及其研究进展.生物法处理木质素对资源的合理利用、经济的发展以及环境保护具有重要的意义.