尖吻蝮蛇毒中一种具有抗补体活性金属蛋白酶的分离纯化及部分性质鉴定

通过离子交换和凝胶过滤层析从湖南产尖吻蝮蛇毒中分离纯化出1个抗补体活性蛋白AACI-I.还原与非还原SDS-PAGE测得其表观分子质量分别为26 kD和22 kD,等电聚焦电泳显示其等电点为pH 8.9.它能抑制补体经典途径和替代途径的溶血,且该作用具有量效和时效性.AACI-I可依次水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ链,此活性能被EDTA、EGTA和1,10-phenanthroline完全抑制,不受PMSF、SBTI作用影响.同时,该蛋白无精氨酸酯酶活性,提示AACI-I是金属蛋白酶.另外,AACI-I具有azocasein水解活性和水肿活性,当0.01μg/g AACI-I注射小鼠足趾,其诱导肿胀率约为(14.06±6.78)%,而小鼠皮下注射2.6μg/g AACI-Ⅰ后没有发现其有出血毒活性.     

烙铁头蛇毒素纤维蛋白原溶酶研究:Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头（T.mucrosquamatus）蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA，但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFg显著延长血浆凝血酶时间、血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时，TMVFg体外也能延长全血凝固时间，表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明：TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片（FDP）除具有抗凝血酶，抑制纤维蛋白聚合活性外，还能促进纤维蛋白的聚合。进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液，得两个FDP断片功能峰，FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成；FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成，抑制TMVA（烙铁头蛇毒血小板活化素，它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集），但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。实验证明，TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的，但在二者之间，前者是主要的。从研究结果发现：TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程，这就发现了FDP断片的新功能。它证明了FDP断片作为血液凝固、纤溶正反馈调节因子的功能。这一类FDP断片还能抑制TMVA诱导的血小板聚集，因此，烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg将成为研究血液凝固调节系统及血小板聚集第三条途径的强有力试剂。     

一种新型具有纤溶活性的沙蚕金属蛋白酶的分离纯化及鉴定

通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱、CM-Sepharose FF阳离子交换色谱和Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱,从沙蚕体内分离纯化出一种新型的具有纤溶活性的金属蛋白酶,命名为NVMP.采用SDS-PAGE和MALDI-TOF MS 质谱检测,该酶是一种分子质量为28~32 kD的单链蛋白,等电聚焦电泳显示其等电点为8.0. NVMP酶活性被EGTA完全性抑制,表明其是一种典型的金属蛋白酶,最适温度为40 ℃,最适pH为6,Cu2+、Co2+和Zn2+可阻断其酶活性,而Ca2+ 和Mg2+可增强蛋白酶活性.经肽指纹图谱分析发现,NVMP是一种未知的新蛋白. NVMP可直接水解纤维蛋白,也可通过激活纤溶酶原转变成纤溶酶的方式,间接水解纤维蛋白.因此,NVMP对预防和治疗血栓性疾病具有一定的药用价值.     

哈维氏弧菌适配子的SELEX筛选及其亲和特异性研究

哈维氏弧菌是水产养殖中的重要条件致病菌,对其进行快速、准确地检测和鉴定是相关病害防治的基础和关键.适配子具有亲和力高、特异性强、稳定性好等优点,在微生物的检测和鉴定方面呈现出广泛的应用前景.本研究以哈维氏弧菌为靶目标,采用SELEX技术,即指数级富集配体的系统进化技术,筛选其特异性适配子.经15轮筛选后,随机ssDNA文库的亲和力从3.51上升到58.95,提高了15.8倍.筛选出的适配子富集库经克隆、测序后得到52条不同序列,根据同源性将这些序列分成8个家族,其中第1和第2家族的适配子数量最多,超过总数的50%.通过深入分析,筛选出6个对哈维氏弧菌有显著亲和特异性(P0.01)的高频适配子,其中5个高频适配子(S1、S25、S26、S27、S35)对哈维氏弧菌有较高的亲和力,相应的亲和常数Kd值分别为(32.6±7.1)、(45.3±10.1)、(24.7±5.8)、(34.8±5.6)、(12.9±4.0)nmol/L.本文还对高频适配子的产生机制及其应用价值进行了探讨.本文首次筛选出了对哈维氏弧菌具有较高亲和特异性的适配子,为后续利用适配子进行哈维氏弧菌的检测和鉴定奠定了基础.     

Selection of HBV preSl-binding penta-peptides by phage display

Chronic hepatitis B virus （HBV） infection can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Current therapies have a very limited efficacy in virus clearance. New anti- viral targets and agents are urgently needed. The envelope of HBV virion contains three surface glycoproteins, namely the large （LHBs）, middle （MHBs）, and small （SHBs） pro- teins. LHBs has an amino terminal preS which is composed of the preS1 and preS2 domains. The amino half of preS1 which is myristoylated plays a pivotal role in HBV entry, which can be exploited as an antiviral target. A common motif of five amino acids had been previously discovered to bind preSll_~s and HBV particles. In this study, we used preSl 1-65 to screen a phage display library of random penta-peptides to select the penta-peptides possessing a high preSl-binding affinity. After nine rounds of panning, we obtained one peptide designated as A5 which could bind preS1 with a high affinity. By systematically substitut- ing each residue of A5 with the other 19 amino acids, we identified a novel peptide with an increased preSl-binding affinity. Both peptides could inhibit HBV attachment to HepG2 cells, making them be potential candidates for HBV entry inhibitors.     

预热处理金针菇蛋白对猪肉肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

本文研究预热处理（preheat treatment,PT）金针菇蛋白（Flammulina filiformis protein,FFP）对肌原纤维蛋白（myofibrillar protein,MP）凝胶特性的影响。试验将FFP在65、75、85和95℃下分别预热处理30、60、90和120min,以蛋白溶解度、总巯基含量和表面疏水性为指标,确定FFP预热处理的最佳温度与时间;将预热处理的FFP（PT-FFP）与MP以不同的比例（0:10、1:9、2:8、3:7、4:6,M/M）混合制备复合凝胶（总蛋白质量浓度均为40mg/mL）,以凝胶强度、持水性、流变学特性与微观结构为指标,考察PT-FFP对MP凝胶特性的影响。结果表明,75℃预热处理60min,FFP的溶解度与表面疏水性最高,总巯基含量最低,故确定该预热处理条件为最佳;将该条件下制备的PT-FFP以不同比例与MP混合制备凝胶,结果发现PT-FFP比FFP更有利于复合凝胶的凝胶强度和持水性的提高（P<0.05）,特别是当PT-FFP与MP混合比例为1:9时,复合凝胶的凝胶强度和持水性达到最高值121.38g和85.25%;流变学结果也表明,PT-FFP能够提高复合凝胶的弹性模量Gʹ和损耗模量G″;电镜观察可以看出PT-FFP与MP复合的凝胶具有更强的连续性,结构更为致密。总之,经过75℃预热处理60min后的FFP和MP以1:9混合时能够改善肌原纤维蛋白凝胶特性和流变学特性。     

不同数量的2kDa富苯丙氨酸的碱性短肽（BOP）和乙醇酸氧化酶结合

乙醇酸氧化酶（GO）只含40 kD亚基却具有多个等电点（pI）.我们曾报告GO含40 kD酸性亚基和68 kD碱性亚基,组成3种GO同工酶［1~6］.后来证实,68 kD亚基由14个2 kD富苯丙氨酸的碱性短肽（BOP）和40 kD亚基组成［7］.现在进一步证实,不同数量的BOP和乙醇酸氧化酶结合,组成多种GO-BOP复合体GC.这些复合体具有不同的pI、乙醇酸氧化酶活性和吸收曲线,但SDS-PAGE和免疫反应相同.在低电压和短时间的醋酸薄膜电泳中,GO和BOP不会解离,GC呈现强碱性（pI>10.0）;在高电压的毛细管等电聚焦电泳(cIEF)中,GO和BOP发生不同程度解离,导致GC不聚焦,或聚焦为不同带,pI为7.4/6.8/6.2/5.3.BOP存在于各种动植物和微生物以及血纤维蛋白原中.     

血清硫氧还蛋白相互作用蛋白、Ⅲ型纤维蛋白结构域结合蛋白5与糖尿病性心肌病的相关性及诊断价值分析

摘要 目的：分析血清硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）、Ⅲ型纤维蛋白结构域结合蛋白5（FNDC5）与糖尿病性心肌病的相关性及诊断价值。方法：选择我院自2019年10月至2022年10月接诊的128例糖尿病患者作为研究对象，其中糖尿病性心肌病53例，作为观察组；左心室二维结构正常75例，作为对照组。检测两组血清TXNIP、FNDC5表达水平，分析糖尿病性心肌病患者血清TXNIP、FNDC5表达水平与左心功能指标的关系，使用多因素Logistic回归分析及ROC曲线分析血清TXNIP、FNDC5对糖尿病性心肌病的诊断价值。结果：观察组血清TXNIP表达水平高于对照组，FNDC5表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经Pearson相关性分析，糖尿病性心肌病患者二尖瓣早期血流速度峰值(E)、左侧壁二尖瓣环早期峰值速度均值（e''）、左心室射血分数（LVEF）均与TXNIP呈负相关，与FNDC5呈正相关（P＜0.05）；经多因素Logistic回归分析，血清TXNIP、FNDC5均是糖尿病性心肌病的独立预测因素（P＜0.05）；经ROC曲线分析，血清TXNIP联合FNDC5诊断糖尿病性心肌病的AUC为0.926，明显大于单一指标TXNIP的0.671和FNDC5的0.685，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：血清TXNIP、FNDC5与糖尿病性心肌病发病及患者左心功能损害程度密切相关，两者联合诊断此病的效能较好，值得临床进一步研究应用。     

以伴刀豆球蛋白为介质定向固定化脲酶的研究

将戊二醛将伴刀豆球蛋白(ConA)和壳聚糖载体交联,然后利用ConA与脲酶糖链的特异性结合作用,实现脲酶的定向固定化.定向固定化的最适条件为戊二醛浓度3.5%、ConA浓度1mg/mL、ConA溶液pH值7.0、脲酶浓度0.4mg/mL.定向固定化脲酶的最适pH 5.0～6.0、最适温度77℃,米氏常数Km11.76mmol/L,与游离酶及非定向固定化脲酶比较,定向固定化脲酶的最适pH向酸性范围发生了偏移并有更宽的pH适用范围,最适温度提高,与底物的亲和力较大,且有较好的操作稳定性.     

人源抗体筛选和表达载体的构建

目的:构建一个可供抗体CDR(决定簇互补区)进行自由替换、筛选、表达的通用载体,并对其生物学功能进行鉴定.方法:在已构建好的具有Fc段的完全人源抗狂犬病病毒抗体表达栽体基础上,利用PCR介导的定点突变技术,引入2个可供CDR3区进行自由替换的限制性酶切位点,构建出通用表达载体.体外合成人源、鼠源抗乳腺癌Her2抗体的CDR3区,克隆至已构建的通用载体,在毕赤酵母中诱导表达.应用ELISA和Western Blotting技术对亲本抗体和新抗体进行生物学及免疫学分析.结果:PCR、Western Blotting等试验表明具有Her2抗原结合活性的人源和鼠源突变型抗体获得成功表达,通过对表达产物的免疫学及功能学检测证明所表达出的抗体具有抗原中和活性,而且鼠源抗体的活性要稍高于人源抗体.结论:成功构建了可用于功能性抗体筛选和表达的通用载体,对抗体的体外亲和力成熟及抗体的人源化有重要意义.