酵母菌的Killer系统及其应用

本文简要介绍了酵母菌Killer系统的遗传学和生化学的基本知识,以及在酵母杂种品系的选择、营养缺陷突变体的富集、重组DNA技术、发酵工业等方面的应用和前景。文章也提出了该研究领域在实际应用中可能遇到的某些局限性。     

不稳定EGFP细胞模型的构建及其在基因编辑体系评价中的应用*

目的:为了更好地评价基因编辑效率,满足高通量筛选应用中快速、高效的检测要求,在细胞上建立一个原位检测方法具有重要的意义。通过检测荧光蛋白信号强度的变化可以评价CRISPR系统在细胞中的基因编辑情况,然而这一方法的效率受限于荧光蛋白较长的半衰期。方法:将鸟氨酸脱羧酶降解结构域(含PEST序列)与EGFP融合,通过慢病毒系统感染HEK-293T细胞,获得了表达单拷贝、EGFP-PEST报告基因的稳转细胞系。结果:与EGFP相比,EGFP-PEST在细胞内的降解速度明显加快,荧光水平在4 h内显著降低。利用该模型比较了3种商品化脂质体介导的CRISPR/Cas9基因编辑效率,能够在2~4 d实现定性和定量评价。结论:这一模型能够快速、灵敏地指示基因编辑效果,可以用于不同CRISPR系统或新递送工具的高通量筛选和评价。     

酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

干旱对不同花椒种植模式下土壤微生物和线虫群落的影响

随着全球气候变暖, 我国岷江上游干旱区面积呈现增加的趋势。花椒(Zanthoxylum bungeanum)是岷江上游重要的经济树种之一, 对当地经济和社会发展起着重要作用, 提高花椒生态系统应对干旱干扰已成为迫切的问题。本研究设置了花椒单作、花椒-苜蓿(Medicago sativa)间作和花椒-大豆(Glycine max)间作3种种植模式, 在2015年8月对每种种植模式模拟干旱30 d, 每种种植模式包括干旱和对照处理, 在模拟干旱结束后、恢复15 d、30 d和45 d后分别采集土壤样品, 分析土壤化学性质、土壤微生物和线虫群落, 以探究花椒林下豆科植物能否缓和干旱的遗留效应对土壤化学性质和土壤生物的影响。重复测量方差分析表明: 在花椒单作模式下, 干旱恢复45 d后土壤硝态氮含量显著高于对照, 微生物量和真菌/细菌比与对照无显著差异, 线虫密度与对照无显著差异, 但线虫功能团没有恢复到对照水平; 在花椒-苜蓿间作模式下, 干旱恢复45 d后土壤含水量、铵态氮、硝态氮、溶解性有机碳、溶解性有机氮、微生物量、真菌/细菌比、线虫密度和线虫功能团组成与对照无显著差异, 但植食性线虫属Boleodorus相对多度显著高于对照; 在花椒-大豆间作模式下, 干旱恢复45 d后土壤含水量、铵态氮、硝态氮、溶解性有机碳、溶解性有机氮、微生物量和真菌/细菌比与对照无显著差异, 但线虫密度和功能团组成与对照有显著差异。在3种花椒种植模式中, 花椒-苜蓿间作模式下干旱的遗留效应对土壤养分和生物的影响最小。因此, 在干旱背景下, 花椒林下间作豆科植物可以加快土壤养分、土壤微生物和线虫群落的恢复, 进而有利于目标作物生长。     

集胞藻 PCC 6803中Sll0875蛋白参与调控光系统I活性的生物功能研究

叶绿醌是由1个萘醌环和1个半不饱和植基侧链组成的一类光系统Ⅰ（photosystem Ⅰ,PSⅠ）特有的辅因子。目前,在蓝藻中对其生物合成途径的研究主要集中在萘醌环的形成方面,而对其植基侧链的合成尚缺乏相关报道。本研究通过与近期在拟南芥中发现的1种催化植基单磷酸形成植基二磷酸的激酶（VTE6）进行同源序列比对,在集胞藻 PCC 6803中发现1个与之高度同源的蛋白质Sll0875。研究发现,在Sll0875缺失突变体中,叶绿醌和生育酚的含量缺失,叶绿素的含量降低（P<0.05）,且该突变体在无葡萄糖培养基中生长迟缓。进一步利用叶绿素荧光、P700氧化还原动力学、77K低温荧光光谱和免疫印迹分析等方法分析了该蛋白质的缺失对PSⅠ功能的影响。研究表明,在突变体Δsll0875中, PSⅠ活性下降,PSⅠ亚基含量与野生型相比显著降低（P<0.01）。这一结果表明,叶绿醌的缺失影响了PSⅠ复合物的累积,导致PSⅠ功能受损,从而影响了蓝藻正常的生长和发育。本研究在蓝藻中证实植醇磷酸化途径对叶绿醌合成的重要性,为进一步研究蓝藻中叶绿醌在PSⅠ复合物的合成、组装和稳定等过程中的作用奠定基础。     

不依赖天然外显子的蛋白质内含子定向进化筛选系统

蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低,极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。为了开发一个可以同时对蛋白质内含子通用性和剪接活性进行筛选的系统,利用Bsa I限制性内切酶识别位点和切割不重合的特性,将Ter ThyX内含子(不含外显子序列)插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点。并且摒弃了以往需要结合天然外显子以实现剪接的方法,可以同时对蛋白质内含子的剪接活性和通用性进行筛选。Western blot结果和卡那霉素平板生长结果表明,通过卡那霉素筛选系统可以精确的将蛋白质内含子剪接反应与卡那霉素抗性结合起来,仅从卡那霉素平板上的菌落生长情况即可完成蛋白质内含子剪接活性阳性突变的筛选,是一个快速,稳定的定向进化筛选系统。     

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)的骨骼特征及系统发育地位

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)已作为新型实验动物而逐渐成为生物学研究各领域的热门对象,但是,其系统分类位置仍存在争议。本研究制作了稀有鮈鲫的透明骨骼标本,对其骨骼特征进行描述;选取47个形态特征,与鲤科各亚科鱼类的典型特征进行比较,建立了分支分析特征矩阵,并使用PAUP4.0软件中的最大简约法(MP)构建系统发育树。结果显示,稀有鮈鲫和鮈亚科鱼类聚在一起,属于鮈亚科。     

利用显微数码互动系统进行“有丝分裂实验”的教学组织

“有丝分裂实验”是高中生物学中一个重要的综合性实验。传统显微镜进行实验教学存在一些弊端,用传统显微镜对该实验进行教学组织主要存在时间紧和成功率低两大问题。使用显微数码互动系统对该实验进行教学组织能够克服这些弊端,取得良好的实验效果。     

北京大学两家附属医院电子病历系统易用性比较研究

??????? 目的 探索并评估、比较北京大学两家附属医院电子病历系统的易用性,并就其出现的易用性问题提出改进建议。方法 使用美国国家标准技术研究所制定的电子病历功能标准测试方法和用例,利用认知研究软件工具CogTool模拟熟练用户在无错误操作情况下使用系统,统计电子病历系统7项关键任务的完成时间。结果 两家医院电子病历系统完成7项测试任务的平均总时间为723.3秒,其中平均心理思考时间为257.7秒。系统A、B完成7项测试任务总时间分别为728.5秒、718.0秒。其中完成用药列表任务时间差异最大。完成人口统计学任务心理思考时间所占的百分比差异最大。结论 由于易用性设计缺陷,医生花费大量的时间进行人机交互;通过改进系统易用性以便减少人机交互总的时间和心理思考时间所占的比例,提高医疗效率。