蛋白质糖基化修饰的研究方法及其应用

蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质糖基化修饰的研究内容与方法,并综述了最近的研究进展。     

碱基切除修复与分枝杆菌基因组稳定性

维持基因组稳定是生物生存的基础。碱基切除修复(base excision repair,BER)是修复损伤DNA、维持基因组稳定的主要方式之一。碱基切除修复对结核分枝杆菌等胞内致病菌尤其重要。fpg编码碱基切除修复的关键酶。本文通过比较分枝杆菌的基因组,发现结核菌较其他非致病分枝杆菌具有更多的碱基切除修复基因。这提示碱基切除修复可能对结核菌在宿主体内存活和致病至关重要。这条途径也许是新结核病药物研发的重要靶标。     

钠离子通道β4亚基糖基化的初步研究

异常表达的糖蛋白与PD等多种神经退行性疾病有关。糖蛋白组学研究发现,电压门控钠离子通道β4亚基在PD病人脑组织中表达明显增加。为了深入探索β4亚基及其糖链在帕金森发生发展中的作用,采用PD转基因鼠对其表达进行验证,对其潜在的糖基化位点进行定点突变,构建重组表达质粒。结果发现,在新生PD转基因鼠和野生成鼠脑组织中有~38kDa蛋白条带表达,而在新生野生鼠脑组织中不表达;用PNGase F酶处理去除糖链后,~38kDa蛋白条带变成迁移速递更快的较小分子量条带,说明β4亚基是高度糖基化的蛋白,并且其糖基化与生长发育有关。将突变重组质粒转入HEK-293细胞和小鼠神经瘤细胞Neuro2A中表达,结果发现突变型质粒分子量明显低于野生型。为研究β4亚基及其糖链的功能提供了一定的实验数据并打下了基础。     

吡哆胺对糖尿病大鼠视皮质AGE-RAGE系统的影响

目的观察吡哆胺对糖尿病大鼠视皮质高级糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)表达的影响,探讨吡哆胺对视皮质的保护作用。方法健康SD大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病未治疗组(DM组)、糖尿病吡哆胺治疗组(PM组)和氨基胍治疗对照组(AG组)各20只,用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,PM组和AG组分别于造模成功后第二天开始予吡哆胺和氨基胍灌胃。各组于治疗4w和12w后取材,用酶联免疫吸附(ELISA)法定量检测大鼠视皮质中AGEs含量,荧光免疫组化及图像分析半定量检测各组视皮质RAGE的表达。结果糖尿病治疗组和未治疗组血糖无显著性差异。4w时各组AGEs含量无明显差异,12w时PM组视皮质中AGEs含量与AG组、NC组比较差异无统计学意义,与DM组相比显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。PM组视皮质中RAGE表达比DM组显著减少,差异具有统计学意义(P0.05),但高于NC组(P0.05)。结论糖尿病大鼠12w后视皮质中AGEs含量和RAGE的表达高于正常对照组,吡哆胺类似氨基胍可减少AGEs的堆积,还能抑制RAGE的表达,减轻AGEs-RAGE通路作用导致的组织损伤,对视皮质具有一定的保护作用。     

CHO细胞表达糖蛋白的研究进展*

中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)表达系统因具有较高密度培养、高表达和相对完整的蛋白质糖基化修饰系统等特点,成为生产糖蛋白广泛应用的宿主表达细胞之一。目前已产生不同的CHO细胞系和各种功能细胞株以满足对糖蛋白的大量生产和其他实验需求。近年来,随着基因工程、蛋白质工程、细胞工程和发酵调控等技术的发展应用,由CHO细胞生产糖蛋白的产量和糖基化修饰程度取得了突破。然而,随着生物制品市场对于糖蛋白的需求增加,如何获得大量、均质的糖蛋白也成为急需解决的问题。综述了不同工程CHO表达系统的研究、应用、糖基化修饰系统,以及影响外源糖蛋白在CHO系统表达和糖基化修饰的理化因素,结合文献总结并预测了未来CHO细胞表达系统研究的四个具有重大意义的研究方向,以期在未来可以改善由CHO细胞表达糖蛋白的产量和质量。     

H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性

不同H5亚型禽流感(AIV)HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚。本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定。结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点。158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上。所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的。因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异。     

艾塞那肽对糖尿病大鼠肾脏损伤的保护作用

目的：探讨GLP-1类似物艾塞那肽（exenatide）对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏的保护作用。方法：SD大鼠随机分为正常组（NC组,n=8）和模型组;模型组给予高脂高糖饲料,喂养4周后腹腔注射STZ（30 mg·kg^-1）建模,72 h后以血糖≥ 16.7 mmol·L^-1为糖尿病成模标准,将成模大鼠随机分为糖尿病对照组（DM组,n=10）、3 μg·kg^-1艾塞那肽干预（Ex-1）组和6μg·kg^-1艾塞那肽干预（Ex-2）组;艾塞那肽组连续皮下注射艾塞那肽（bid）12周,NC组和DM组注射等容积溶剂;测定各组大鼠糖脂代谢变化和肾功能指标如血肌酐（Scr）、尿肌酐（Ucr）、尿素氮（BUN）、24 h尿微量白蛋白排出率（24 h UMA）并计算肌酐清除率（Ccr）;测定肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）;HE染色观察肾组织病理形态及ELISA法测定肾组织糖基化终末产物AGEs水平。结果：与糖尿病组相比,艾塞那肽可明显改善糖尿病大鼠糖脂代谢,血糖、糖基化血红蛋白（HbAlc）、甘油三脂及胆固醇值均下降（P < 0.05）,肾功能指标明显好转（P < 0.05）且肌酐清除率下降（P < 0.05）,提示肾小球高滤过状态;同时改善糖尿病引起的肾组织病理结构改变,AGEs浓度下降（P < 0.05）,氧化应激指标SOD和GSH-Px活力升高,MDA含量降低（P < 0.05）。结论：艾塞那肽具有肾脏保护作用,其机制可能与抑制糖尿病大鼠肾组织的AGEs生成和改善氧化应激有关。     

酵母N-糖基化工程研究进展

酵母表达系统可用来生产具生物活性的重组糖蛋白,但其在N-糖基化过程中会生成高甘露糖型糖链。通过引入相关的甘露糖苷酶和糖基转移酶基因、切断酵母自身的高甘露糖链形成通道能够改变酵母宿主N-糖基化的类型。本对酵母N-糖基化工程的研究状况、最新进展及存在问题作简要阐述。     

糖基化终末产物（AGEs）诱导下SOCS基因在肾小管上皮细胞中的表达及意义

目的观察SOCS-1、SOCS-3在肾小管上皮细胞（HKC）中的基础表达及在糖基化终末产物（AGEs）诱导下的表达及意义。方法体外培养HKC细胞,随机分为正常对照组、AGEs组,倒置显微镜观察细胞形态学改变,采用流式细胞术,免疫细胞化学和检测SOCS-1、SOCS-3蛋白表达,RT-PCR法检测HKCSOCS-1、SOCS-3 mRNA表达。结果与正常组比较,AGES诱导的肾小管上皮细胞发生形态学改变;免疫细胞化学、流式细胞学发现SOCS-1、SOCS-3表达以胞浆为主,散在胞核表达;12、24、48hSOCS-1、SOCS-3蛋白表达AGEs组均高于正常对照组,差异有统计学意义,其中SOCS-1以12h表达量最大,SOCS-3以24h表达最高,RT-PCR检测SOCS-3 mRNA表达量,AGEs组高于正常组,差异有统计学意义。结论SOCS-1、SOCS-3在正常肾小管上皮细胞中有基础表达,AGEs可诱导肾小管上皮细胞SOCS-1、SOCS-3表达上调,为我们进一步研究SOCS基因与糖尿病肾病的关系提供了理论依据。     

糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白转化法—一门全新的细胞 …

糖基化磷脂酰肌醇（ＧＰＩ）锚定蛋白是一种新型细胞表面蛋白,它只通过ＧＰＩ结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构;当它与细胞共同孵育时,可自动整合至细胞膜表面。ＧＰＩ锚定蛋白转化法利用ＧＰＩ锚定信号将目的蛋白直接整合至靶细胞表面,超越了目的蛋白靶细胞自身合成的机制,具有对靶细胞选择性不高,转化过程迅速等优点,在抗原提呈细胞工程,肿瘤疫苗及移植物抗排斥反应等研究领域得到了广泛应用。