重组胶原蛋白的产业发展历程和生物医学应用前景展望北大核心CSCD

重组胶原蛋白作为天然动物组织胶原的替代物具有广泛应用于生物材料、生物医学等领域的潜力。种类繁多的重组胶原蛋白类型及其衍生体在多种表达系统中可实现一定规模的产业化生产,为探索和拓展重组胶原蛋白的临床应用奠定了基础。文中简述了重组胶原蛋白的不同表达体系,如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物和人类细胞表达体系,重组胶原蛋白的优势及潜在的应用和局限。着重介绍了目前重组胶原蛋白生产,包括不同表达体系的构建策略和重组胶原蛋白羟基化修饰等方面的研究进展,总结了重组胶原蛋白在生物医药领域的应用及应用基础研究和应用前景展望。     

木瓜蛋白酶酶解鱼鳞提取胶原蛋白的工艺研究

用木瓜蛋白酶水解鱼鳞提取胶原蛋白,对影响酶解过程的的主要因素(酶量、温度、底物浓度)分别作为单因素进行了实验。并通过正交实验得到鱼鳞胶原蛋白提取条件的优化组合,同时对提取物进行了分析检测。结果表明,木瓜蛋白酶对鱼鳞有较好的水解效果,酶用量宜采用4g/L,最佳温度为60℃,底物浓度宜选择20%。     

鳖源胶原蛋白提取纯化及在生物材料中的应用

近年来,胶原蛋白因其良好的生物学性能在生物材料应用中得到越来越多的关注,为了建立一种快速高效的鳖源胶原蛋白纯化方法和探究其在生物材料中的应用价值,首先用Van Gieson染色法和苦味酸-天狼星红染色法观察裙边胶原纤维组织结构,发现裙边胶原纤维含量非常高且类型主要是Ⅰ型。采用不同截留分子量的透析袋对裙边胶原蛋白粗提液进行直接透析纯化,发现截留分子量为100 k Da的透析袋在透析48 h后对裙边胶原蛋白的纯化效果最好,SDS-PAGE检验显示几乎没有杂带。对裙边胶原蛋白生物学性能包括吸水性、体外降解性进行考察,其吸水力和持水力分别高达12.06 g/g和98.21%,且在72 h后被完全降解;对裙边胶原蛋白海绵的溶血性、皮肤致敏性、肝部创伤止血性、促创伤皮肤愈合性进行了研究,并和交联胶原进行比较,发现裙边胶原蛋白和交联胶原均不会造成SD大鼠溶血和皮肤过敏,二者均具有良好的止血效果,且裙边胶原蛋白能显著缩短创伤皮肤愈合时间,具有良好的促创伤皮肤愈合性,而交联胶原效果欠佳。本研究表明裙边胶原蛋白表现出了优良的生物学性能,在生物材料领域具有很大应用价值。     

霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原抗疲劳作用的实验研究

本文对霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原的抗疲劳作用进行了研究。试验中分别以25、50、100mg/kg剂量的霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原给小鼠连续灌胃30d,然后进行小鼠负重游泳试验、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸含量测定。结果显示,两种受试物各剂量组小鼠的游泳时间明显长于对照组(P0.05或P0.01),各剂量组小鼠运动后血清尿素氮含量及乳酸曲线下面积均低于对照组(P0.01);各剂量组的小鼠游泳后肝糖原含量和空白对照组比较均有不同程度的提高。从而表明,霞水母胶原蛋白活性肽和寡肽胶原均具有抗疲劳作用。     

胶原蛋白-壳聚糖支架的构建及其与骨髓基质干细胞复合的实验研究

目的:构建一种组织工程神经支架,并观察体外培养的骨髓基质干细胞在其内部的生长情况,为后续种子细胞的移植提供阶段性实验数据.方法:以Ⅰ型胶原蛋白和壳聚糖为原料通过冷冻干燥技术制备神经支架,扫描电镜观察其内部结构,测量其孔径大小、孔隙率等指标.将体外培养的骨髓基质干细胞与Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖神经支架复合,共培养2天;扫描电镜观察细胞在支架内部的生长情况.结果:构建的神经支架均为圆柱状,内部为纵向平行排列的孔径均匀的微管样结构,细胞紧密贴附在支架微孔内壁上,细胞生长状况良好.结论:Ⅰ型胶原蛋白-壳聚糖支架具有良好的内部三维结构和生物相容性,可与细胞复合后用于修复周围神经缺损.     

胶原蛋白的电子活性与矽肺纤维化——Ⅰ正常大鼠与实验性矽肺大鼠肺Ⅰ型胶原的驻极体特性

本文对正常大鼠与实验性矽肺大鼠肺Ⅰ型胶原的驻极体特性进行比较研究.大鼠肺Ⅰ型胶原未经电场极化即可产生空间电荷性质的热刺激去极化电流(TSDC),表明具有天然驻极体特性.电场极化的TSDC实验说明肺胶原具有很显著的极化特性.矽肺肺胶原TSDC各峰峰位温度高于正常肺胶原,分子运动受到较大限制,紫外照射后TSDC强度的增加比较小.矽肺胶原固有极化潜力明显的弱于正常肺胶原,取极向活化能高于正常肺胶原.     

产碱性蛋白酶芽孢杆菌的鉴定

通过测量比较在碱性蛋白平板上产生的蛋白水解圈直径,从土壤中筛选到一株高产蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079,根据生理生化特性、16S rDNA序列,鉴定为B.amyloliquefaciens。其最适培养温度为35°C-37°C,最适生长pH 8.0,在特定培养条件下16 h达到稳定期,菌体生长和蛋白酶合成同步进行。以大豆分离蛋白为氮源时发酵液具有最高酶活。发酵液在pH 10时具有最高酶活,表明为碱性蛋白酶。该菌株产生的碱性蛋白酶可水解多种天然蛋白质,对胶原蛋白水解度高于其他蛋白质,对羽毛角蛋白也有一定水解能力,提示该酶具有一定新颖性。     

转录因子Osterix对成骨细胞Col1a1基因的反式激活作用

Osterix（Osx）是一种具有锌指结构的转录因子,对骨形成十分重要. 但到目前为止,直接接受Osterix调控的靶基因尚不清楚.用骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）诱导原代培养小鼠成骨细胞的骨分化,定量RT PCR检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ a 1, Col1a1)与Osx的转录水平.结果发现,二者的转录时相具有相同的变化模式.为了确定二者之间的关系,采用腺病毒表达系统在原代成骨细胞中过表达Osx. 数据表明,Osx能够明显上调Col1a1的转录水平.用EMSA（electromobility shift assay）检测这些过表达Osx基因的成骨细胞核抽提物,迁移条带的出现表明,Osx能够直接与Col1a1的启动子相结合.结果提示,在原代培养的成骨细胞中,Osterix通过直接与启动子相结合,调控Col1a1基因的转录.     

胶原蛋白的电子活性与矽肺纤维化——Ⅰ正常大鼠与实验性矽肺大鼠肺Ⅰ型胶原的驻极体特性

本文对正常大鼠与实验性矽肺大鼠肺Ⅰ型胶原的驻极体特性进行比较研究.大鼠肺Ⅰ型胶原未经电场极化即可产生空间电荷性质的热刺激去极化电流(TSDC),表明具有天然驻极体特性.电场极化的TSDC实验说明肺胶原具有很显著的极化特性.矽肺肺胶原TSDC各峰峰位温度高于正常肺胶原,分子运动受到较大限制,紫外照射后TSDC强度的增加比较小.矽肺胶原固有极化潜力明显的弱于正常肺胶原,取极向活化能高于正常肺胶原.     

重组人源胶原蛋白对激光损伤小鼠皮肤修复作用及机制研究

本研究旨在观察重组人源胶原蛋白(recombinant human collagen,r-hc)对小鼠皮肤激光损伤的修复作用,初步探索其作用机制。应用458~514 nm激光照射小鼠背部皮肤制作皮肤损伤模型,将r-hc外涂于创伤皮肤,剂量为8 mg/mL(生理盐水配制),每天涂抹1次,连续给药14 d。分别于给药后1、4、7、14 d用双光子显微镜收集二次谐波(second harmonic generation,SHG)信号检测伤口真皮中的胶原纤维,并进行常规HE染色,观察伤口局部的病理学改变。体外试验检测r-hc对人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞增殖活力的影响,计算细胞存活率。在小鼠模型上显示,与对照组相比,r-hc可明显加速伤口的愈合,缩短伤口愈合时间; SHG显示r-hc能够促进创伤局部胶原的产生;体外试验也显示它有促进人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞增殖的能力。由此可见,r-hc(8 mg/mL)对小鼠激光损伤皮肤有修复作用,可能是通过促进表皮角质细胞和真皮成纤维细胞的增殖,促进胶原的沉积而发挥修复作用的。