克隆基因转入植物细胞的一般方法

本文介绍一种能将任何克隆基因转入植物细胞的方法,而不论其基因末端或中间的限制酶切点如何。已经构建了一种寄主范围很广的中间载体pGV1117,在其兰曙红着色的pTiC58质粒右端T-区片段含有Hind Ⅲ-23。利用EcoRI甲基化酶和EcoRI接头的连接在胞内所起的保护作用、将带有兔子β-珠蛋白基因的一段染色体DNA插入pGV1117质粒。转移到根瘤病土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以后,通过体内重组把该基因插入pTiC58的T-区。受损伤的烟草幼苗被感染后,导致完整的珠蛋白基因作为T-DNA的一部分而转入植物基因组。虽然,在组织培养期间,这个基因能被稳定保留,但是在转化植株细胞中没有检测到β-珠蛋白特异的转录本。     

向基因疗法接近

今年夏天在给生来就患酶缺乏病人移植缺失基因的努力方面,向现实化迈进了一大步。加洲圣地亚哥的两个研究小组合作,试图以还原病毒为人基因的转移载体来恢复Lesch—Nyhan综合征病人的培养细胞中的酶合成作用。     

变形杆菌的耐药性及接合性R质粒的检测

本文报告了从烧伤病人感染创面分离、鉴定的35株变形杆菌的药敏试验及接合性R质粒的检测结果。35株变形杆菌双测试的6种抗菌药物都具有不同程度的耐药性。其中,对6种药物同时耐受的有26株(74.3％)。对其中的27株做了接合试验,接合性R质粒的检出率为70.4%。     

双拷贝人α型心钠素基因的组建及大肠杆菌分泌型克隆与表达

将单拷贝人α心钠素基因3′端用Ban Ⅱ酶解除去包括终止密码在内的36个碱基对,代之以人工合成的含Glu-Lys-Phe-Glu连接片段与另一单拷贝人α心钠素基因的5′端串连成编码60肽的双拷贝心钠素基因,克隆于大肠杆菌分泌型表达载体pIN-Ⅲ-OmpA_2质粒中,表达生成60肽的双拷贝人α型心钠素衍生物,在信号肽的作用下分泌至胞膜间质并自动切割为60肽的外源基因产物。分子量约8K的表达产物用分子筛或超滤膜分离后再经HPLC纯化,表达产物具有明显的心钠素放免活性和舒张血管活性。     

苏云金杆菌6－内毒素基因及3’末端缺失基因在大肠杆菌和农杆菌中的亚克隆和表达

苏云金芽孢杆菌交种Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 δ-内毒素基因及其3,末端缺失基因,亚克隆到质粒pUCl9上,构建了Pucf33和Puck63重组质粒。进一步将δ-内毒素基因及其3’端缺失基因,插入到植物表达载pBl121．2质粒中,构建了Pgy61和Pgyck63重组质粒。．用32P标记的δ-内毒素3’末端缺失的KpnI DNA片段的探针,与重组质粒进行DNA—DNA分子杂交,结果阳性。带有全长和3’末端缺失重组质粒,转入大肠杆菌HB101和农杆菌LA4404受体细胞中,其克隆子细胞抽提物,对大菜粉蝶和玉米螟幼虫均具有杀虫生物活性。结果证明δ－内毒素基因不仅能在大肠杆菌HB10l中,而且能在农杆菌LA4404中表达。     

人表皮生长因子基因的化学合成和克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了人表皮生长因子基因,全长为173个核苷酸,它被分成8个寡核苷酸,分别在DNA合成仪上合成。经分离纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接,然后被克隆到噬菌体M13mpl8中,克隆经分子杂交、限制酶酶切以及DNA序列分析检测,证明合成的人表皮生长因子基因和设计的完全一致。将人表皮生长因子基因的DNA片段插入酵母分泌型表达载休YFD59 HindⅢ位点中,建成表达人表皮生长因子基因的质粒YFDl04,再将此质粒转化酿酒酵母,所得转化子经摇瓶发酵,发酵上清液用受体结合试验表明有人表皮生长因子表达。     

利用电穿孔技术实现质粒向酵母原生质体的转化

本实验的主要目的旨在摸索电场对基因转化的最佳条件.已得到初步结果为:用酿酒酵母S.cerevisiae DBY 746作为穿梭质粒(YRp类)的受体菌.经过对最适电场条件与基因转化率之间关系的研究,我们发现在1个400μS的宽时程脉冲、电场强度为4KV/cm时有最高转化率,达273个转化子/μgDNA.本实验所用的电穿孔装置是自组装的,它简便、快速、实用.     

K_(99)—F_(41)双纤毛菌的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻、K_(99)和F_(41)是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的纤毛抗原。 提取K_(99)质粒,用HindⅢ酶消化,再用低熔点琼脂糖电泳回收分子量约为11Md的K_(99)的HindⅢ片段,并将该片段与经过碱性磷酸酶处理的PBR322载体重组,转化大肠杆菌C_(600)。用ELISA筛选K_(99)抗原阳性克隆。 E.coli83919F_(41)~+是非致病的产生F_(41)纤毛抗原的野生菌株。且F_(41)抗原基因是由染色体编码的。采用转化的方法将K99人工重组质粒转化到E.coli83919F_(41)~+中构建成K_(99)—F_(41)双纤毛基因工程菌。双纤毛菌中K_(99)抗原表达达到给体菌的水平,而F_(41)抗原的表达未受到明显的干扰。