大鼠Otos基因RNA干扰质粒体的构建

目的:构建其基因Otos的RNA干扰质粒载体,为研究Otospiralin在内耳的生理功能奠定基础。方法:在GenBank中查到大鼠Otos基因的序列,输入到相应的设计软件中,以此设计引物序列,经过PCR扩增,酶切后,克隆于pAVU6 27载体并行酶切鉴定。结果:构建的鼠Otos shRNA载体经过测序鉴定,所得和预期相符。结论:重组质粒pAVU6 27-Otos的成功构建为下一步研究打下良好的基础。     

CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

毛白杨乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶基因(PtFATB)的克隆与表达分析

植物脂肪酸合成的主要部位是叶绿体,叶绿体向外运输脂肪酸的种类和数量受到乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(FATB)控制。FATB基因在植物生长过程起着非常关键的作用。本研究以毛白杨为材料,将生物信息学知识和分子生物学手段相结合,首先利用现有的杨树基因组EST序列库资源,通过同源序列搜索,经过多次拼接合并获得了理论的杨树脂肪酸去饱和酶基因PtFATB序列全长,利用RT-PCR手段成功克隆得到了毛白杨FATB基因全长编码序列cDNA,该cDNA全长1,450bp,包括起始密码子ATG和144bp的5′末端非编码区,终止密码子TGA和40bp的3′末端非编码区,开放阅读框编码421个氨基酸。通过RT-PCR半定量研究了PtFATB在叶片组织中的表达量最高,茎、根中的表达量依次降低。在低温、干旱、NaCl、ABA四种条件下诱导生长24h,只有在低温的条件下发现PtFATB表达量略微降低,其他几种情况未有变化,该结果表明PtFATB呈组成型表达。上述结果为植物脂肪酸的基因工程提供了基础。     

基于同义密码子使用的原核生物基因组大、小染色体及质粒进化特征分析北大核心CSCD

基于同义密码子偏好分析,对54个原核基因组大、小染色体及质粒中蛋白质编码基因的序列特征进行了对比分析。结果表明,大、小染色体中蛋白质编码基因的GC含量分布相近,质粒中蛋白质编码基因的GC含量分布与所在物种全基因组的GC含量差别较大。进一步的分析表明,大、小染色体共同偏好的密码子最多,且具有相近的起始密码子和终止密码子使用特征。基于对应分析的同义密码子使用模式分析表明,大、小染色体具有相近的序列特征,且大、小染色体及质粒之间具有不尽相同的影响因素。这些结果可为今后原核生物基因组进化研究提供可靠的方法和理论依据。     

新型重组糖蛋白表达载体--盘基网柄菌

近年来,盘基网柄菌作为异源重组糖蛋白表达载体的研究受到了学术界的重视,已经有多种具有生物活性的复杂糖蛋白成功地得到了表达。通过对表达产物的研究发现,盘基网柄菌具有各种翻译后加工机制,例如磷酸化、酰基化及形成GPI(糖基磷脂酰基醇)锚点等,具有类似于高等动物的糖基化修饰能力。与哺乳动物细胞表达载体相比较,盘基网柄菌具有培养成本低廉、细胞生长迅速及易于大规模培养的优势。盘基网柄菌有可能发展成为一种有重要应用前景的糖蛋白表达载体系统。     

SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2双价重组腺病毒载体疫苗可在小鼠诱导免疫保护

评价一种SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2新型重组双价疫苗在小鼠模型中的免疫保护效果。本研究构建了表达SARS-CoV-2南非变异株(B.1.351)棘突蛋白1(S1)和H3N2柬埔寨分离株(A/Cambodia/e0826360/2020)血凝素(HA)的重组双价非复制Ad5载体疫苗,命名为HAdV5-S1-2A-HA,经单针肌肉注射免疫BALB/c雌鼠后,采用ELISA、血凝抑制实验、假病毒中和实验与Elispot实验进行体液与细胞免疫学检测,免后3～6周采用H3N2-X31病毒、H1N1-PR8与SARS-CoV-2(B.1.351)进行攻毒保护实验。HAdV5-S1-2A-HA免疫两周后,低剂量组(1×10⁸vp/只)免疫小鼠后可检出HA特异体液免疫与S1特异的细胞免疫应答;而高剂量组(5×10⁹vp/只)诱导小鼠产生了较强的双抗原(S1,HA)特异的体液和细胞免疫应答,并能完全保护小鼠对H3N2-X31攻击,降低SARS-CoV-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死...     

陆地棉GhSDP1及其启动子的克隆与表达分析

三酰基甘油脂肪酶(SDP1)是催化三酰甘油降解的关键酶,在植物油脂代谢调控中起着重要作用。克隆棉花SDP1并研究其在3种胁迫下的表达分析,为解析棉花SDP1的生物学功能提供依据。以陆地棉品种冀丰1271为试材,克隆GhSDP1编码序列和上游启动子序列;利用PlantCARE分析GhSDP1启动子区顺式作用元件;qRT-PCR检测逆境胁迫下GhSDP1的表达谱;通过烟草瞬时表达pGhSDP1启动子+GUS载体检测启动子活性。结果表明,GhSDP1的编码序列为2 541 bp,其在盐、低温和干旱胁迫下呈差异表达模式。pGhSDP1除具有启动子所必需的TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个与光响应、激素响应及逆境应答等相关的顺式作用元件。棉花pGhSDP1启动子能驱动GUS蛋白高效表达,具有较强的启动子活性。研究揭示了棉花GhSDP1参与胁迫应答的新功能。     

RNA干扰作用研究进展

RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)是指与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA分子 (double strandedRNA ,dsRNA)导入细胞时 ,该mRNA发生特异性的降解 ,导致基因表达的沉默。本文介绍RNAi作用的发现、机制和目前使用的产生RNAi的方法     

酪氨酸羟化酶和左旋芳香族氨基酸脱羧酶基因的细胞表达及活性检测

由于在帕金森病中合成多巴胺所需的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC)活性明显降低,所以补充多巴胺合成酶成为基因治疗帕金森病研究的主要手段。我们分别构建了重组逆转录病毒载体pLHCX／TH及pLNCX2／AADC,通过脂质体介导将带有目的基因的载体分别转到包装细胞PA317中,经筛选得到产病毒的细胞PA317／TH和PA317／AADC,采用免疫组化、原位杂交方法检测目的基因表达;细胞经裂解后进行的酶促反应产物多巴胺以高压液相电化学方法检测证明所克隆的T‘H及AADC基因具有功能活性;这两种基因工程改造细胞可以完成酶促动力学的功能,使L-dopa及多巴胺产生明显增加。本研究为用TH和AADC双基因对帕金森病进行基因治疗提供了一定的依据。     

大鼠坐骨神经切断后外源性bcl-2对脊髓运动神经元的保护作用

采用大鼠坐骨神经切断损伤模型,行神经外膜端端对线缝合,术中依不同组别,动物于神经缝合处远端0．5cm处分别注射人的正义和反义bcl-2重组腺病毒(Ad／s-bcl-2、Ad／as-bcl-2),报道基因重组腺病毒(Ad／lacZ)和生理盐水。术后48h,7d,15d和30d常规灌注固定大鼠,取L4-L6脊髓节段,应用X-gal染色、bel-2原位杂交和免疫组化染色、TUNEL染色以及乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学染色方法,观察到外源基因能在脊髓中表达,同时外源性Ad／s-bcl-2能显著减少L4到L6节段脊髓前角运动神经元凋亡的数目,减少脊髓前角运动神经元中因坐骨神经切断导致的AChE活性的降低幅度,并加快其恢复。而Ad／as-bcl-2可显著增加坐骨神经切断诱导的脊髓前角运动神经元凋亡数目以及AChE活性降低幅度,并延缓其恢复。这些观察结果表明,外源性bcl-2能保护周围神经切断后引起的脊髓运动神经元损伤。