狂犬病病毒颗粒的蛋白质组学分析

狂犬病病毒是一种囊膜RNA病毒,主要侵害中枢神经系统,引起人和哺乳动物致命性的脑脊髓炎。现有研究表明囊膜病毒颗粒从感染的细胞中出芽释放时会携带许多可能在病毒的复制过程中发挥重要作用的宿主蛋白。尽管先前已报道某些宿主蛋白可掺入到狂犬病病毒颗粒上,但还没有系统地鉴定狂犬病病毒颗粒上的蛋白质组成。为了理解病毒与宿主间的相互作用的分子机制,本研究在病毒培养和蔗糖密度梯度超离心纯化的基础上,采用蛋白质组学方法分析了纯化的狂犬病病毒颗粒(SRV9弱毒疫苗株)上的蛋白质组成。除了检测到狂犬病病毒编码的五个结构蛋白以外,我们还检测到了50个宿主编码的蛋白。按功能可将其分成十类:胞内转运蛋白(14%),分子伴侣(12%),细胞骨架蛋白(24%),信号转导蛋白(8%),转录调节蛋白(12%),钙离子结合蛋白(6%),酶结合蛋白(6%),代谢作用蛋白(2%),泛素化蛋白(2%),其他功能的蛋白(14%)。利用免疫印迹方法对病毒颗粒上的4个宿主蛋白(肌动蛋白,微管蛋白,微丝结合蛋白和热应激同源蛋白70)进行了验证。本研究首次鉴定了狂犬病病毒颗粒上的宿主蛋白组成,有助于进一步研究该病毒复制与感染机制。     

表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析

为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3(Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗。体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答。该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+CD4+T细胞亚群。采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护。本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考。     

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定

登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位(Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392)。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1E蛋白氨aa 381~392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。     

高温胁迫对Bt棉铃壳中Bt蛋白含量及氮代谢的影响

以Bt基因来源于中国的棉花品种泗抗1 号(常规种)、泗抗3 号(杂交种)和来源于美国的棉花品种99B(常规棉)、岱杂1 号(杂交棉)为材料,研究了不同高温水平下Bt 棉盛铃期铃壳中Bt 蛋白含量变化及氮代谢生理特征.结果表明: 铃壳中Bt 蛋白含量随温度升高而降低,与对照相比(32 ℃),常规棉品种在38 ℃、杂交棉品种在40 ℃以上时,铃壳中Bt 蛋白含量大幅度下降.其中,常规种泗抗1号和99B在38 ℃时分别下降53.0%和69.5%;杂交种泗抗3号和岱杂1号在40 ℃时下降64.8%和54.1%.铃壳Bt 杀虫蛋白含量下降显著时,其可溶性蛋白含量明显下降,游离氨基酸含量明显提高,GPT活性显著下降,蛋白酶活性显著增加.高温影响铃壳的氮代谢引起Bt蛋白的分解加剧,合成减弱,从而造成Bt蛋白含量减少,抗虫性下降.     

杆状病毒编码的内核膜分选模序研究进展

摘要:杆状病毒(Baculovirus)是一类在自然界中专一性感染节肢动物的病原微生物,其宿主主要为鳞翅目、双翅目及膜翅目昆虫。杆状病毒感染其宿主细胞时产生多种整合膜蛋白,通过细胞连续膜系统,从内质网、外核膜到内核膜,并最终定位到病毒粒子囊膜上。杆状病毒编码的内核膜分选模序作为一种蛋白分选信号序列,在此过程中发挥关键作用。本文对杆状病毒编码的内核膜分选模序研究进展进行综述,包括其作为一种新型蛋白定位信号的分子作用机理和分选作用模型,以及与杆状病毒经口感染之间的关系。这些研究不仅在分子水平上丰富和补充了人们对蛋白分选机制的认识,而且对于杆状病毒分子生物学研究和应用具有重要的推动意义。     

反相C18固相萃取小柱用于蛋白质组分析中少量样品预处理

针对少量且复杂蛋白质组样品,开发一种耗时短、操作简便的分离方法。以人的脑海马组织蛋白样品为研究对象,采用反相C18固相萃取小柱,采用不同乙腈浓度对酶切后样品进行梯度洗脱,与反相高效液相色谱法对比分离效果。通过比较不同乙腈梯度洗脱方案所鉴定到的谱图数、非冗余多肽数、蛋白数和各洗脱组分间重复率分析,确定一种样品量少、简单易行、分离效果好的实验方案。虽然反相C18固相萃取小柱法鉴定蛋白总数占高效液相色谱法的85.5%,但其操作简单,耗时少。通过4种不同乙腈浓度方案比较,确定乙腈洗脱浓度优化为5%、15%、20%和90%时,分离30μg人的海马多肽混合物可以得到较优的分离效果。其蛋白鉴定数为反相液相色谱法的67.0%,且重复性良好。该结果证实反相C18固相萃取小柱分离效果比反相高效液相色谱法稍差,但此方法可以分离少量复杂蛋白质组样品。该方法分离样品充分,操作易行,耗时短,是进行蛋白质组学分析中少量样品的一个简便预处理方法。     

禽网状内皮组织增殖病病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及其识别区分析

为了制备禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白的单克隆抗体,应用His-gp90融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过筛选、3次亚克隆后获得3株稳定分泌抗REV-gp90蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为3G5-B8、3G5-A10和1G12。经间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测,单克隆抗体的亲和力解离常数(Kd)分别为6.483×10–10、4.844×10–10和9.330×10–10,3株单抗的亚型分别为Ig G1、Ig G1和Ig G2b。经Western blotting和间接免疫荧光实验检测,3株单抗均能识别REV感染DF-1细胞后产生的gp90蛋白。以Western blotting方法利用单抗检测不同截短的gp90蛋白,初步确定3G5-B8和3G5-A10 2株单抗抗原识别区均位于gp90蛋白第200-245位氨基酸,而1G12株单抗识别区包含第230-235位氨基酸。这些单抗为REV的诊断和致病机理研究奠定了基础。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

SAA和CRP联合检测在小儿感染性疾病鉴别诊断中的应用价值

目的探讨血清淀粉样蛋白A(SAA)和C-反应蛋白(CRP)联合检测在小儿感染性疾病鉴别诊断中的临床价值。方法选取2012年1月至2013年12月间住院患儿166例,分为细菌感染组72例,病毒感染组94例,采用免疫比浊法检测急性期和恢复期水平,并与30例健康儿童进行比较分析。结果细菌感染组SAA和CRP浓度显著高于病毒感染组和对照组,病毒感染组SAA显著高于对照组(P0.05)。细菌感染组中重症组SAA和CRP浓度显著高于轻症组,轻症组SAA和CRP浓度显著高于对照组(P0.05)。SAA和CRP单独检测阳性率较低,两者联合检测能提高检出率。结论 SAA和CRP联合检测在小儿感染性疾病鉴别诊断、疗效动态观察中有重要应用价值。     

HPV16 E6蛋白在宫颈癌中的作用研究进展

高危型人乳头状瘤病毒16型(HPV16)与50%以上的宫颈癌密切相关,其E6癌蛋白作为病毒生命周期的主要蛋白之一,在诱导肿瘤发生与发展进程中起重要作用,且与病毒复制、宿主细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、细胞恶性表型转化有关。E6蛋白主要作用包括:通过结合E6相关蛋白降解P53抑制细胞凋亡;增强端粒酶活性使宿主细胞永生化;与Daxx启动子区结合,抑制启动子转录活性,降低Daxx蛋白表达,阻遏细胞凋亡;与多种细胞因子相互作用后,经多种途径改变细胞微环境,使之有利于肿瘤细胞逃避宿主固有免疫应答。因此,在宫颈癌的发生和发展中,HPV16 E6蛋白通过多种作用机制发挥重要作用。