一种新的短链脱氢/还原酶家族新成员:NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因的克隆和分析

从牛的肝脏中快速抽提总RNA,根据GenBank已发表NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因(NRDR)的cDNA序列,设计并合成特异引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),得到牛肝内的NRDR cDNA的全长序列。经测序证实,牛肝NRDR的全长cDNA序列为1266bp,其开放读码框架在24～806bp,编码260个氨基酸(GenBank登录号：AF487454)。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序,在其C-端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。     

基因体外诱变的一种新方法--脱氧核苷三磷酸替代法

在PCR的过程中,采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的方法,对克隆的野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变.结果表明,BrdUTP浓度越高,诱变越强;浓度越低,诱变越弱.当BrdUTP浓度为dTTP的0.1%时,可以得到最多的正诱变结果.用LBSP鉴别培养基初筛,然后用Yoo改良法测定酶活,仅一轮诱变就获得了其表达产物α-淀粉酶的酶活分别降低了5倍和提高了20倍的两个突变基因.再以后者为PCR模板进行第二轮诱变,从而筛选到了α-淀粉酶的酶活提高40倍的突变体.此诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题,并为基因的体外诱变找到了一条新途径.     

△12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

把高山被孢霉(Mortierella alpina)和深黄被孢霉(Monierella isabellina)的△^12-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中,获得重组表达载体pMACL12和pMICL12,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌B121(DE3)中。筛选阳性克隆进行培养,然后分离其细胞膜蛋白,并构建体外表达体系,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱(GC)分析表明,分别有17．87％和17．60％的油酸转化为亚油酸。     

免疫细胞内源性儿茶酚胺的免疫调节作用

机体内儿茶酚胺（catecholamines,CAs）包括去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、肾上腺素（epinephrine,E）和多巴胺（dopamine,DA）。CAs由神经元和内分泌细胞合成和分泌,其主要功能是调节心血管、呼吸和消化等内脏活动。近三十年来的研究说明,CAs也参与调控机体的免疫功能,但CAs的这种免疫调节作用一般视为神经和内分泌系统调节的介导作用。然而,近年来的研究发现,免疫细胞也能合成CAs,这是对传统观念的一种补充和提高。免疫细胞内存在经典的CAs代谢途径,既有合成CAs的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）又有降解CAs的单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）和儿茶酚氧位甲基移位酶（catechol-O-methyl transferase,COMT）。免疫细胞合成的内源性CAs可以调控细胞的增殖、分化、凋亡和细胞因子生成等多种免疫功能。CAs的这些作用可能主要通过自分泌或旁分泌途径作用于免疫细胞上相应受体和细胞内环磷酸腺苷（cyclicAMP,cAMP）实现。细胞内氧化应激机制可能也参与免疫细胞内源性CAs的免疫调节作用。此外,一些自身免疫性疾病如多发性硬化、风湿性关节炎可能也与免疫细胞内CAs的代谢异常有关。上述发现不仅为免疫系统有可能成为除神经和内分泌系统以外的第三个CA能系统提供了证据,而且为免疫系统内源性CAs的功能意义拓展了认识。     

重金属铅对鲫鱼乳酸脱氢酶和过氧化氢酶活性的影响

在实验室条件下,采用毒性实验方法研究不同浓度重金属铅(Pb2 )对鲫鱼血清乳酸脱氢酶(LDH)和血液过氧化氢酶(CAT)活性的影响.研究结果表明,随着金属离子铅浓度的增高血清中乳酸脱氢酶和过氧化氢酶活性下降,但两种酶对铅离子影响的敏感程度不同.影响LDH活性的最低铅离子浓度为0.1mmol/L,而CAT为0.5mmol/L,当Pb2 浓度为1mmol/L时,LDH活性降至10%左右,而CAT仅下降50%左右.对重金属离子浓度与酶活性的定性和定量分析为有效监控鱼类生存环境提供了有价值的参考资料.     

重组枯草芽抱杆菌的构建及对街体的Cl , 2 位脱氢

本文将简单节杆茵3-甾酮-1-脱氢酶基因克隆到分泌表达载体pWB980上,并转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到重组芽孢杆菌菌株。重组芽孢杆菌表达出的目的蛋白的分子量为55KDa,分光光度法检测到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0．5mU和15±0．6mU每毫克蛋白,对甾体底物4-AD的转化率为45．3%,比出发茵简单节杆菌提高了将近10倍。     

人精子特异性乳酸脱氢酶结构和功能的计算生物学分析

精子特异性乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）,又称乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4,LDH-C4）,特异性地存在于哺乳动物发育成熟的睾丸组织中,与精子的生成、代谢、获能等有密切关系. 根据GenBank数据库中人LDH-C4氨基酸序列（P07864）,利用PROSITE数据库预测人LDH-C4的功能基序|利用Clustalw2、TreeView1.6.6进行LDH-C4进化树的构建|利用I-TASSER软件预测人LDH-C4的二、三、四级结构以及功能位点. 结果表明：在190~196位有1个LDH活性位点,该位点为脊椎动物各亚型乳酸脱氢酶共有的催化位点,为进化中的1个保守序列|从进化树来看,LDHC和LDHB的亲缘关系比较近|人LDH-C4与小鼠LDH-C4的二级、三级结构具有很高的相似性|LDH-4属乳酸脱氢酶 苹果酸脱氢酶（LDH-MDH）超家族中的LDH-(cd05293）家族的成员,属于NAD依赖性酶,拥有LDH-1家族具备的基本结构特点. 以上结果为研究LDH-C4基因突变对其功能的影响打下基础.     

重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应

丙酮酸磷酸双激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK; EC 2.7.9.1）能够可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate, PEP）、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate, AMP）和焦磷酸盐（pyrophosphate, PPi）生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）、无机磷酸盐（orthophosphate, Pi）和丙酮酸（pyruvate）.以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到了编码PPDK的基因,将此基因片段插入表达载体pET24a (+),在大肠杆菌中表达C端融合His-Tag的重组PPDK.与我们先前表达的N端融合His-Tag的PPDK相比,酶的活性提高了20倍,提示该酶的N端对活性十分重要.重组PPDK单体分子量为98 kD.经过镍亲和层析和超滤后,重组PPDK基本达到电泳纯.重组PPDK与荧光素酶偶联能够形成1个ATP-AMP循环反应,在该循环反应中,荧光素酶催化ATP生成的AMP和PPi能够被PPDK重新转化成ATP,产生一个持续稳定的信号.     

烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶共表达对大肠杆菌BA002产丁二酸的影响

大肠杆菌BA002是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因 (pflB) 的工程菌。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。pncB是烟酸转磷酸核糖激酶 (NAPRTase) 的编码基因,通过过量表达pncB基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+,从而恢复了厌氧条件下重组菌E. coli BA014 (BA002/pTrc99a-pncB) 的生长和产丁二酸的性能。然而,BA014在厌氧发酵过程中有大量丙酮酸积累,为进一步提高菌株的丁二酸生产能力,减少副产物丙酮酸的生成,共表达NAPRTase和来自于乳酸乳球菌 NZ9000中丙酮酸羧化酶 (PYC) 的编码基因pyc,构建了重组菌E. coli BA016 (BA002/pTrc99a-pncB-pyc)。3 L发酵罐结果表明,BA016发酵112 h后,共消耗了35.00 g/L的葡萄糖。发酵结束时,菌体OD600为4.64,产生了25.09 g/L丁二酸。通过共表达pncB和pyc基因,使BA016的丙酮酸积累进一步降低,丁二酸产量进一步提高。     

鸡胚胎干细胞能量代谢的特点

细胞能量代谢与细胞生命活动紧密相关, 但目前对于鸡胚胎干细胞能量代谢特点的研究较少. 本研究利用前期建立的chES细胞模型, 通过电子显微镜发现未分化的chES细胞胞质内储存大量糖原颗粒和卵黄颗粒. 逆转录-聚合酶链反应对能量代谢途径中的主要限速酶的基因表达分析显示, 未分化的chES细胞不表达丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶, 与鸡胚胎成纤维细胞相比低表达葡萄糖转运蛋白1和磷酸果糖激酶, 高表达己糖激酶1和糖原合成酶; 分化中的chES细胞与成年母鸡肝脏相比少量表达PCX和PCK2, 与CEF细胞相比高表达GLUT1, HK1, PFK, 而GYS的表达没有显著性差异. 过碘酸希夫氏染色显示, 细胞培养过程中未分化chES细胞中储存的糖原颗粒未见减少, 而分化中的chES细胞的糖原颗粒逐渐减少. 此外, 通过赫斯特荧光染料33342和碘化丙啶双染色发现, 大量未分化的chES细胞在体外培养过程中死亡, 而添加外源性6-磷酸葡萄糖显著减少细胞死亡. 上述结果说明, 未分化chES细胞主要以糖原合成为主, 无糖异生代谢, 而分化中的chES细胞以糖酵解代谢为主. 未分化的chES细胞以大量消耗代谢中间产物G6P为代价进行糖原合成, 造成细胞内源性G6P相对不足引起细胞死亡. 因此, 细胞内糖原的含量反映了chES细胞的分化程度. chES细胞在体外培养时可通过添加G6P来提高生存率.