大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD~+菌株,对于NAD~+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD~+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD~+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD~+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD~+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD~+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coli BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD~+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD~+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD~+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD~+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD~+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD~+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。     

基因组选择技术在农业动物育种中的应用

基因组选择(genomic selection, GS)是畜禽经济性状遗传改良的重要方法。随着高密度SNP芯片和二代测序价格的下降,GS技术越来越多被应用于奶牛、猪、鸡等农业动物育种中。然而,降低全基因组SNP分型成本、提高基因组育种值(genomic estimated breeding value,GEBV)估计准确性仍然是GS研究的主要难题。本文从全基因组SNP分型策略和GEBV估计模型两个方面进行了综述,并对目前GS技术在主要畜禽品种中的应用现状进行了介绍,以期为GS在农业动物育种中的深入开展提供借鉴和参考。     

MC‐UVE波长选择法在近红外光谱鉴别茯苓产地中的应用研究

利用近红外光谱鉴别云南不同产区药用真菌茯苓。采用光谱标准偏差法(SSD)和蒙特卡罗无信息变量消除法(MC-UVE)逐步筛选光谱信息,利用K-S算法将白茯苓和茯苓皮划分训练集和验证集,并结合偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)分别构建不同产区白茯苓和茯苓皮的分类模型,进一步建立不同产区茯苓的Fisher判别方程。结果表明:(1)通过主成分-马氏距离(PCA-MD)分析,白茯苓和茯苓皮的近红外光谱在主成分得分空间内呈现出较大差异,构建不同产区茯苓鉴别模型应将白茯苓及茯苓皮分开。(2)最优主成分数为5时,采用SSD筛选的886个变量(7 501.74–4 088.35cm~(-1))构建的白茯苓和茯苓皮的分类模型,其R~2、RMSECV和RMSEP分别为0.986、0.988;0.320、0.283;0.425、0.395;采用MC-UVE法分别筛选出白茯苓和茯苓皮光谱信息(34个、22个变量)建立的分类模型,其R~2、RMSECV和RMSEP分别为0.993、0.991;0.224、0.255;0.298、0.355。采用MC-UVE结合PLS-DA法建立的分类模型,有效降低了冗余信息,白茯苓和茯苓皮的R~2均有所提升,RMSECV和RMSEP均有所降低,预测正确率分别由85.71%和83.33%,提高至100%。(3)进一步采用逐步判别分析法筛选出白茯苓(6个)和茯苓皮(4个)光谱变量,建立Fisher判别方程,回代验证正确率均大于85.7%,交叉验证正确率均大于66.7%,表明所建立的Fisher判别方程能较好地鉴别不同产区的茯苓。     

前外侧入路治疗髋关节置换术患者的疗效及对血清CRP, IL-6,D-二聚体水平的影响分析

目的:探讨前外侧入路治疗髋关节置换术患者的疗效及对血清C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、D-二聚体水平的影响。方法:选择2013年2月~2015年1月经由我院诊治的102名人工髋关节置换术患者,均征求患者的意愿分为观察组和对照组。对照组54例通过常规的入路方式进行髋关节置换术,观察组48例采用前外侧入路方式进行髋关节置换术。手术前后比较两组患者的血清CRP、IL-6和D-二聚体水平,并通过随访比较两组患者的疗效。结果:治疗后,观察组患者的总有效率显著高于对照组(P0.05),两组患者的血清CRP、IL-6及D-二聚体在手术后12 h时升高,在7 d和14 d时,逐渐下降。观察组患者血清CRP、IL-6及D-二聚体水平在术后12 h、7 d和14 d均明显低于对照组(P0.05)。结论:前外侧入路对髋关节置换术患者的临床疗效较常规入路方式更显著,且可有效降低血清CRP、IL-6和D-二聚体水平,更加有利于患者的术后恢复。     

沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病的疗效与安全性分析

目的:探讨沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病的疗效与安全性。方法:选取200例2型糖尿病患者,按随机数字表法分为两组,沙格列汀组(102例)口服沙格列汀联合二甲双胍治疗,阿卡波糖组(98例)口服阿卡波糖联合二甲双胍治疗。通过观察并记录治疗前后糖代谢情况与体重指数水平,SF-36量表各项评分,治疗期间不良反应情况,评价沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病的疗效与安全性。结果:治疗后,两组HbAlc,BMI,FBG,2hPBG水平均明显下降(P0.05),且沙格列汀组患者HbAlc,BMI,FBG,2 hPBG水平明显低于阿卡波糖组(P0.05);治疗后3个月两组患者SF-36表各项评分均明显提高(P0.05),但两组间差异没有统计学意义(P0.05);随访期间,两组不良反应率相比,差异没有统计学意义(P0.05)。结论:沙格列汀联合二甲双胍可以明显控制患者血糖水平,减轻患者体重,提高患者生活质量用药安全性好,值得临床推广使用。     

四氯化碳联合二乙基亚硝胺对小鼠肾脏毒性作用的研究

为了研究四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)联合二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)对小鼠肾脏组织的毒性损伤作用,将30只雄性昆明鼠随机分为对照组和实验组,其中实验组小鼠每周2次腹腔注射15%CCl_4花生油溶液,并且自由饮用0.07%DEN溶液;而对照组小鼠注射等量的纯花生油,自由饮用纯净水,观察并记录各组小鼠的饮水、进食情况和体重变化,以及生活状态的改变。在实验过程中,分别于第3、6、8周解剖两组小鼠各4只,取其肾脏组织样本进行病理方面的组织切片观察。体重统计结果显示,与对照组相比,实验组小鼠体重明显下降。同时,实验组小鼠的肾脏系数明显高于对照组,并且具有显著差异(P0.05)。组织切片观察发现,对照组小鼠肾脏组织结构比较清晰,排列较规则,而实验组小鼠肾脏组织呈现出显著的变性和坏死;且随着处理时间的延长,肾脏组织变得散乱无规则,细胞凝集现象越来越明显,肾小管与集合小管管腔变窄,颗粒样变性。上述结果表明CCl_4联合DEN对小鼠肾脏具有损伤效应,处理时间越长,损伤作用越严重。     

虫媒传粉植物荞麦的生物学特性与研究进展

荞麦是禾本科之外的谷物类作物, 具有较高的营养和药用价值。栽培荞麦有甜荞(Fagopyrum esculentum)和苦荞(F. tartaricum), 这两种一年生草本分别为自交不亲和的二型花柱、自交亲和的同型花柱植物; 前者结实依赖昆虫传粉。根据国内外调查研究, 前人对蓼科荞麦属(Fagopyrum)记录了30个物种名, 已有形态学和遗传多样性的调查表明该属的物种多样性中心位于我国西南地区, 特别是长江上游的三江并流区域; 甜荞和苦荞的起源地和祖先物种也认为在该区域。本文在论述前人研究的基础上, 指出对荞麦属的分类修订、野生种质资源的分布、种间关系的调查、优良品种的选育亟待研究。孢粉学和考古学的证据显示在我国长江流域, 人们在4,500年前就开始种植荞麦。荞麦可能曾经是山区人民的主粮, 为孕育长江流域文明提供了食物资源。加强对荞麦基础生物学特性的研究, 运用现代基因组学的方法有望澄清栽培荞麦的起源并探究产量不高的原因, 挖掘和利用其经济和药用价值的性状, 为荞麦成为一类优良的粮食作物提供参考依据。     

适用于降解样本的201个遗传标记检测体系的构建和验证

近年来,法医实践中复杂案件数量逐渐增多,需要联合使用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)、单核苷酸多态性(single nu cleotide p olymorphis ms,SNP)、插入缺失多态性(insert ion/deletion p olymorphism,InDel)、微单倍型(microhaplotype,MH)等不同类型的遗传标记,为案件提供更多的参考信息。本研究筛选了24个常染色体STR(autosomes STR,A-STR)、24个Y染色体STR(Y-STR)、110个A-SNP、24个Y-SNP、9个A-InDel、1个Y-InDel、8个MH和Amelo genin共201个遗传标记,建立二代测序检测体系HID_AM Panel v1.0。根据DNA分析方法科学工作组(Scientific Working Group on DNA Analy sis M ethods,SWGDAM)的验证指南,对该体系的重复性、准确性、灵敏度、对降解样本的适用性、物种特异性、抗抑制性等指标进行评估。本体系分型结果与基于毛细管电...     

栽培甜菜卵细胞、合子及二细胞原胚的超微结构

为丰富被子植物生殖生物学资料, 并为甜菜相关研究提供参考, 应用透射电镜技术研究栽培甜菜(Beta vulgaris)卵细胞、合子和二细胞原胚的超微结构特征。结果如下：在成熟卵细胞中多聚核糖体数量不多, 且细胞代谢活性较弱; 初期合子内, 核仁大量合成核糖体前体物质, 胞质中多聚核糖体数目众多, 细胞代谢活性较强; 休眠期合子的核仁变小, 胞质中核糖体数量急剧减少, 仅有少量多聚核糖体, 细胞代谢活性较弱; 合子分裂前期和二细胞原胚期, 核仁显著, 胞质中核糖体的密度增加, 出现大量多聚核糖体, 细胞代谢活性较强。根据上述结果可以得出, 栽培甜菜从卵细胞成熟→合子初期→合子休眠期→合子分裂前期→二细胞原胚的超微结构变化中多聚核糖体的变化最为显著, 表现为“少→多→少→多”的数量变化过程, 反映出细胞代谢状态也经历了“弱→强→弱→强”的变化过程, 这种变化趋势与配子体世代向孢子体世代转变有关。     

合成性信息素对柑桔潜叶蛾的田间引诱作用

目前柑桔潜叶蛾的防治主要依赖化学农药, 而且生产中缺少有效测报技术。为此, 我们于2009年6月30日至10月6日在浙江宁波通过有机合成柑桔潜叶蛾Phyllocnistis citrella（鳞翅目, 细蛾科）的3种性信息素化合物顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛、顺7, 顺11-十六碳二烯醛和顺7-十六碳烯醛, 配制成不同浓度比例的混合物, 进行田间试验比较其引诱活性。结果表明, 单一的顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛对柑桔潜叶蛾雄蛾就可以显示较强的引诱作用, 而顺7, 顺11-十六碳二烯醛单一成分没有引诱活性, 顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛与顺7, 顺11-十六碳二烯醛的二元混合物30∶1~3∶1之间活性较强, 而在30∶1的质量比例时诱虫量最高。含顺7-十六碳烯醛的三元混合物, 当顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛∶顺7, 顺11-十六碳二烯醛∶顺7-十六碳烯醛三者比例为100∶10∶3时有显著增效作用。剂量与诱捕活性试验显示每枚诱芯1 mg顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛的剂量引诱作用最强, 随浓度降低, 引诱作用下降。诱捕器在0.8~1.5 m之间的不同悬挂高度对诱捕数量无显著影响。结果说明, 顺7, 顺11, 反13-十六碳三烯醛、顺7, 顺11-十六碳二烯醛和顺7-十六碳烯醛组成的三元混合物诱芯可以作为柑桔潜叶蛾的诱杀技术并应用于其生物防治和预测测报。