日本沼虾两种抗脂多糖因子的特性研究

为了研究抗脂多糖因子ALFs在日本沼虾先天性免疫中的功能作用, 研究从日本沼虾中克隆了2种抗脂多糖因子MnALF1、MnALF2。MnALF1 cDNA 全长1008 bp, 编码121个氨基酸; MnALF2 cDNA 全长836 bp, 编码124个氨基酸。这2种氨基酸均包含有一个信号肽序列和一个LPS结合位点, 并且在结合位点的两端(N-端和C-端)都有2个保守的半胱氨酸残基。这2种MnALFs与之前发现的甲壳动物的ALFs是非常相似的。qRT-PCR结果显示MnALFs在所有被检测的组织中均有表达。其中MnALF1主要在心脏和小肠内表达, 而MnALF2则主要在血细胞和肝胰脏中表达。在用嗜水气单胞菌刺激之后发现2种MnALFs在心脏、小肠、血细胞、肝胰脏中都呈现出明显的时间依赖表达模式(MnALF1在刺激之后呈现出先减少后增加的趋势, 之后分别在不同组织的不同时间点达到最大值; 然而, 对于MnALF2, 在心脏和小肠中先减少后增加, 在血细胞和肝胰脏中呈现出先增加后减少, 最后都在24h达到最大值)。结果提示这2种MnALF具有不同的组织特异性, 并且在细菌侵染的免疫防御中起着重要的保护作用。     

草鱼TRIM32基因克隆表达及功能研究

TRIM (Tripartite-motif protein) 家族是机体先天性免疫的重要成员, 参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程。为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用, 实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长, 共1980 bp, 编码660个氨基酸。草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域, 与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高, 遗传进化分析也聚为一支。间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达, 主要以点状分布在细胞质中, 细胞核中表达量较少; 组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达, 其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织; 不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明, TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05), 随后表达量下降, 直到出膜后表达量再次显著性升高。此外, 双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路, 诱导下游的炎症反应。结果显示, 草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内, 并参与机体的天然免疫反应, 对于抵抗病原体的入侵具有重要作用。     

MiR-26b是前列腺癌中的抑癌微RNA

microRNAs（又称miRNAs或miRs）是一类长度为19-24个核苷酸的单链非编码RNA分子。miRNA通过与其靶向的mRNA分子序列特异性互补配对,调节mRNA表达水平,抑制转录后的蛋白翻译。miRNA在肿瘤中既可作为致癌因子也可作为抑癌因。本研究前期已报道miR-26b在前列腺癌细胞系中低表达,并且抑制细胞自噬。本研究进一步全面揭示miR-26b对前列腺肿瘤细胞的作用。我们发现过表达miR-26b能够在体外抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭,并抑制裸鼠体内原位异种前列腺肿瘤的生长。为了探究miR-26b对前列腺癌细胞增殖和侵袭的潜在调控机制,我们进行了表达谱芯片鉴定miR-26b调控基因。表达谱芯片分析表明,在前列腺癌细胞系PC-3中过表达miR-26b后,显著上调的基因57个,显著下调的基因55个（变化倍数均大于2,且P值小于0.05）。差异基因的功能多与细胞增殖、凋亡调控、蛋白磷酸化和泛素化修饰调控过程相关,并且富集在多种信号通路中,例如TNF和TGF-β信号通路。在这些筛选出的基因中,CEACAM6表达水平下调2.17倍;序列分析及实验验证表明,CEACAM6的3’UTR区存在miR-26b的互补序列,是miR-26b的直接靶标。本研究证明了miR-26b能够靶向结合抑制CEACAM6的表达,从而抑制前列腺癌细胞在体外和体内的细胞增殖和侵袭活性,miR-26b是前列腺癌中的抑癌microRNA。     

大豆KUP/HAK/KT钾转运体基因家族的鉴定与表达分析

该研究基于已公布的大豆基因组序列信息,对大豆KUP/HAK/KT钾转运体基因家族进行了全基因组鉴定,并对该家族成员的基因特征、蛋白结构、染色体定位、基因复制和表达模式等进行了全面分析,为进一步了解该家族基因的功能及培育钾高效大豆品种提供理论支撑。结果表明:(1)在大豆基因组中共鉴定30个KUP/HAK/KT基因(简写为GmHAK01~GmHAK30),这些基因分布在大豆的15条染色体上,串联复制和片段复制可能导致了GmHAKs基因在大豆基因组中的扩增。(2)大豆GmHAKs蛋白间序列一致性很高,均具有12~14个跨膜区,且都定位于质膜上。(3)进化分析表明大豆GmHAKs可聚为4个进化簇ClusterⅠ~Ⅳ,其中ClusterⅡ的成员数目最多(16个),ClusterⅣ的成员数目最少(1个)。(4)所有GmHAKs基因均包含内含子和外显子,其内含子数目在7~9个之间,且同一亚家族的GmHAKs基因大部分具有相似的内含子-外显子分布模式。(5)表达模式分析表明,大豆GmHAKs的表达大致可分为两类:一类是一些组织特异性表达的基因,包括了ClusterⅠ和ClusterⅣ的全部成员,ClusterⅡ的部分成员,他们在根(GmHAK30和GmHAK04)、花(GmHAK03和GmHAK15)、荚(GmHAK10)或种子(GmHAK25)中表达量很高;另外一类是一些非组织特异性表达的基因,包括了ClusterⅢ的全部成员和ClusterⅡ的部分成员,这些基因(GmHAK05、GmHAK17和GmHAK28等)在所有被检测的组织中均有较高的表达;KUP/HAK/KT家族基因表达模式在不同进化簇的差异化结果表明,其在进化过程可能受到了选择的作用。以上研究结果为今后研究KUP/HAK/KT家族基因功能及定向改良大豆的钾吸收物性提供了重要的基因信息,也为大豆钾高效品种的选育提供了理论基础。     

‘云香’水仙ACC合成酶基因NtACS1的克隆及遗传转化

为探究多花水仙ACS基因的序列特征及功能,以‘云香’水仙盛花期花瓣为试验材料,根据‘云香’水仙花朵转录组数据信息,通过RT-PCR方法克隆出1个ACS基因,命名为NtACS1(GenBank KX082936);NtACS1开放阅读框(ORF)长度为552bp,编码183个氨基酸。编码蛋白质分子量约为20.6KDa,理论等电点为6.30,不稳定系数为65.49,属于不稳定的疏水性蛋白。通过qRT-PCR对‘云香’水仙不同时期花瓣和副冠中的NtACS1基因进行了表达分析,得到与‘云香’水仙花朵转录组数据中相同的结果:NtACS1基因在‘云香’水仙花瓣和副冠中的表达都是随着花衰老过程呈现逐渐下降的趋势,且NtACS1基因在花瓣和副冠中的表达峰值都在花苞期,表明NtACS1基因编码的蛋白是在乙烯生物合成途径的系统1发挥催化作用的ACC合成酶。成功构建了NtACS1基因的正义植物表达载体,并通过农杆菌介导法获得8株转基因烟草,PCR和RT-PCR检测显示其中有6株为阳性植株,初步证实NtACS1基因已导入烟草基因组中且在烟草中已表达。该研究结果为进一步分析NtACS1基因的功能和后续转化水仙延长其花期研究奠定了基础。     

蒙古冰草Lhcb1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

利用同源序列从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)克隆得到1个光合作用叶绿体结合a/b基因,命名为MwLhcb1。MwLhcb1基因cDNA全长1 138bp,包含801bp开放阅读框,编码267个氨基酸,蛋白分子量为28.21kD,等电点4.92。该蛋白二级结构中具有Lhcb基因家族的保守结构域。MwLhcb1蛋白氨基酸序列与其他物种同类蛋白相似性均在87%以上,其中与小麦同类蛋白相似性程度最高达99%。实时荧光定量PCR结果显示,MwLhcb1基因主要在茎叶中表达,在根中表达量极少,干旱胁迫影响MwLhcb1基因表达。该研究结果为进一步研究MwLHcb1在蒙古冰草光合作用与抗旱性中的功能奠定了基础,并从基因遗传进化角度证实了蒙古冰草是小麦野生近缘种的观点,从而提出蒙古冰草是小麦抗性改良的理想基因供体。     

沙棘PEPCK基因的克隆及表达研究

以沙棘为研究对象,通过RACE、基因克隆和定量PCR技术,克隆并分析沙棘磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(PEPCK)的序列信息,以及进化树构建和氨基酸的二级结构分析,比较NaCl胁迫后PEPCK基因的表达变化,为揭示PEPCK基因在沙棘抗性方面的功能研究奠定基础。结果显示:(1)成功克隆了沙棘PEPCK基因,该基因开放阅读框(ORF)为2 001bp,编码666个氨基酸。(2)序列分析表明,沙棘PEPCK与蓖麻、黄顶菊、核桃等序列一致性高达85%以上;进化上沙棘PEPCK基因与蓖麻和狭叶羽扇豆较近,与烟草、拟南芥进化关系较远。(3)在300mmol·L~(-1) NaCl盐胁迫下,沙棘PEPCK基因表达在胁迫组中显著上升,胁迫后7d时为未处理的2.5倍,15d时达到未处理的3.2倍。研究表明,沙棘PEPCK基因在沙棘适应外源盐胁迫的过程中可能发挥了重要作用。     

石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

家鸡G蛋白偶联受体161的基因克隆、分子进化和组织表达

G蛋白偶联受体161(GPR161)是G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员,在哺乳动物晶状体发育调节和神经胚形成中具有重要作用。近年来研究发现该蛋白罕见地拥有类似支架蛋白的结构特征,暗示其信号转导机制不同于其他G蛋白偶联受体。本研究以家鸡Gallus gallus为动物模型,探究GPR161基因序列信息、分子遗传进化关系以及其组织表达图谱。家鸡GPR161基因编码区序列全长1 566 bp,编码具521个氨基酸的前体蛋白。序列分析显示,家鸡GPR161基因编码区与人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、斑马鱼Danio rerio的氨基酸相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。分子进化遗传分析结果显示,GPR161基因在家鸡与斑马鱼的进化关系比家鸡与人或小鼠都更为疏远。利用荧光定量PCR探究家鸡GPR161基因在各组织的表达分布,结果显示,家鸡GPR161基因mRNA在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高表达。本研究是鸟类中关于GPR161基因的首次报道,研究结果为进一步探究GPR161基因在鸟类中的生理效应提供参考。     

Burkholderia cepacia胆固醇酯酶及其分子伴侣基因的串联表达及酶学性质的研究

为实现胆固醇酯酶的可溶性表达,以Burkholderia cepacia ST-200胆固醇酯酶为研究对象,将酶及其分子伴侣通过人工添加的SD序列在大肠杆菌中进行串联表达。通过SDS-PAGE电泳分析,胆固醇酯酶成功获得可溶性表达,摇瓶水平的总酶量为1 077 U/L。经过镍柱纯化之后可以获得一条相对分子量约为37 kDa的单一条带。利用圆二色谱解析胆固醇酯酶的二级结构,并测定Tm值,从最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性等方面对胆固醇酯酶进行研究,结果表明该酶在pH为7.0,45℃条件下表现出最大活力。