烟草甲细胞色素P450还原酶基因的分子特征与表达模式分析

烟草甲Lasioderma serricorne是一种重要的仓储害虫,长期化学防治导致烟草甲已对多种传统熏蒸剂产生抗性,但其对新型熏蒸剂甲酸乙酯仍处于敏感水平。因此明确其体内细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase, CPR）对甲酸乙酯的代谢解毒功能,对开展该药剂的抗性监测及延缓抗性的发生发展具有重要意义。本研究旨在克隆烟草甲LsCPR基因,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在烟草甲对甲酸乙酯解毒代谢过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术克隆烟草甲LsCPR基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）;利用生物信息学软件分析LsCPR编码蛋白的结构、特征和系统进化关系。采用实时定量PCR技术检测LsCPR在烟草甲不同发育阶段（低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫、高龄成虫）、幼虫不同组织（表皮、肠道、脂肪体和马氏管）以及甲酸乙酯熏蒸胁迫后的表达模式。烟草甲LsCPR基因的ORF为2 046 bp（GenBank登录号：MZ423209）,编码681个氨基酸,具有典型的昆虫CPR基因FMN区域、NADPH区域和FAD等保守结构域。系统发育分析表明,烟草甲LsCPR与鞘翅目昆虫聚为一支,且与赤拟谷盗Tribolium castaneum CPR亲缘关系最近。LsCPR在烟草甲不同发育阶段均有表达,在高龄幼虫期的表达水平较高;在幼虫体内的表达部位主要在肠道,其次为脂肪体和马氏管,而在表皮的表达水平最低。LC10、LC30和LC50 3种浓度的甲酸乙酯处理24 h后,烟草甲LsCPR表达量随着胁迫浓度升高而上调且显著高于对照;甲酸乙酯LC50处理烟草甲不同时间（3、6、12、24和48 h）后,LsCPR基因上调表达,24 h时达到表达高峰。推测LsCPR是参与烟草甲代谢甲酸乙酯的候选基因。     

管氏肿腿蜂毒液过敏原3基因的克隆及表达分析

为研究管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液过敏原3基因SgA3的功能,通过RT-PCR克隆SgA3基因,采用荧光定量PCR分析其在不同发育阶段和组织中的表达特征,并利用载体pSUMO-Mut对其进行原核表达。克隆获得SgA3基因开放阅读框长699 bp,编码233个氨基酸,其中信号肽位于N端第1~23位氨基酸。多序列比对分析发现,SgA3与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、粉蝶盘绒茧蜂Cotesia glomerata、红火蚁Solenopsis invicta和常见黄胡蜂Vespula vulgaris过敏原3的氨基酸序列一致性分别为50.44%、50%、48.89%和47.83%。荧光定量PCR结果表明,SgA3基因在雌成虫中高表达,且在毒液器官中的表达量显著高于雌成虫其他组织和雄成虫中的表达量。利用pSUMO-Mut表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的SgA3重组蛋白。该研究结果为进一步研究SgA3基因的功能奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌的cry2A芽孢期启动子和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa蛋白表达的影响

[目的]分析苏云金芽孢杆菌的cry2A型芽孢期启动子对晶体蛋白Cry11Aa的协调作用和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa表达的促进功能.[方法]3个包括cry11Aa编码区的重组质粒pHcy1、pHcy2和pHcy4被构建并电激转化到苏云金芽孢杆菌晶体缺陷株4Q7中,其中pHcy1质粒携带cry11Aa基因自身启动子和分子伴侣p19基因,pHcy2携带cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因,pHcy4质粒在pHcy1的上游插入了cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因.SDS-PAGE分析了Cry11Aa蛋白在各重组苏云金菌株中的表达情况,并通过生物测定确定了其对蚊虫的生物活性.[结果]SDS-PAGE结果表明,Cry11Aa蛋白在4Q7(pHcy1)和4QT(pHcy4)均获得了表达,在4Q7(pHcy2)中未检测到Cry11Aa蛋白,推测晶体蛋白Cry11A不能利用cry2A型启动子进行表达调控;Cry11Aa蛋白在等体积4Q7(pHcy4)培养液中的表达量是4Q7(pHcy1)菌株的1.25倍,暗示着分子伴侣ORF1-ORF2在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量.4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)形成的Cry11Aa蛋白晶体的形状和大小相似,两者对致倦库蚊的生物活性没有明显差异,LC50s分别为59.33 ng/mL和66.21 ng/mL,.[结论]推测晶体蛋白Cry11A能否成功表达与其使用启动子的类型和两者的协调配合有关.分子伴侣ORF1-ORF2虽然在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量,但对提高Cry11Aa蛋白的杀蚊毒力没有显著性帮助.     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

基于CRISPR-dCas9转录激活系统的毛果杨ANT转录因子功能分析

基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达。该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨（Populus trichocarpa）中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析。首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料。结果表明：毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达。基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用。获得...     

金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

海岛棉GbTCP5基因的克隆与表达分析

该研究根据前期海岛棉的转录组数据,通过PCR技术从海岛棉‘新海21’中克隆1个TCP基因,命名为GbTCP5,其开放阅读框945bp,编码314个氨基酸,预测分子量约34.95kD,等电点8.41;多序列比对结果表明,GbTCP5蛋白含有特征性的TCP保守结构域;进化树分析表明,GbTCP5基因与GhTCP17基因在同一分支。qPCR实验结果表明,GbTCP5基因在35d纤维中表达量较高,暗示其可能参与棉花纤维的次生壁合成。酵母单杂交实验表明,GbTCP5在SD-Trp-His-Ade缺陷培养基上生长并且X-gal检验显蓝色,说明该基因在酵母体内具有转录激活功能。     

猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定

验证基于革兰氏阳性增强基质(Gram-positive enhancer matrix,GEM)展示口蹄疫病毒细菌样颗粒(Bacteria-like particles,BLP)疫苗的可行性。按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成基于猪口蹄疫病毒Mya98株序列的3种抗原基因设计,并将其插入到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体p QZ-PA,鉴定阳性后转入Escherichia coli BL21,进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因表达及产物的可溶性进行分析。利用GEM颗粒纯化目的蛋白,制备细菌样颗粒疫苗抗原;利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度,将重组蛋白与白油佐剂乳化,制备疫苗,免疫5周龄小鼠,同时设商品化多肽苗对照与空白对照,免疫后不同时间采集试验小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒和O型口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平;利用噻唑蓝比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)测定淋巴细胞增殖情况;利用荧光定量PCR方法检测相关细胞因子表达,评价细胞免疫水平。SDS-PAGE结果表明,设计在大肠杆菌中的3种口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式获得高效表达;Western blotting结果显示,表达的重组蛋白能够与口蹄疫病毒阳性血清发生反应,利用GEM颗粒能够实现重组蛋白的一步离心纯化,制备BLP疫苗抗原;免疫试验结果表明,设计的重组抗原B(T1BT2)4B不但能够刺激免疫小鼠产生更高水平的多肽特异性ELISA抗体与口蹄疫特异性液相阻断抗体,而且产生了更高水平的脾淋巴细胞增殖及Th1型的细胞因子分泌。初步实验结果表明,本研究制备的BLP疫苗GEM-B(T1BT2)4B具有良好的免疫原性,为研究口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗开辟了一条新的思路。