AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素E方法的建立

目的:利用AlphaLISA技术,建立新型均相检测方法,对金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)进行检测。方法:采用2种SEE抗体建立AlphaLISA检测方法,羊抗肠毒多克隆抗体同受体微球偶联,SEE小鼠单克隆抗体标记生物素,并同偶联了亲和素的供体微球连接,3种组分与待测抗原形成双抗体夹心结构,680nm的光激发供体微球产生能量,将周围反应体系中的氧分子转变为激发态,并将能量传递给受体微球,产生520~620nm的荧光,荧光信号与抗原浓度正相关。对该方法的反应体系进行优化,验证其重复性、敏感性和特异性,并采用该方法检测菌液上清和食品模拟样本。结果:所建立的AlphaLISA检测方法重复性较好,批间变异系数和批内变异系数皆小于10%;检测SEE的灵敏度可以达到100pg/mL,并与其他几种毒素均无交叉反应,具有较好的特异性。该方法也能够准确地对金黄色葡萄球菌菌液上清中的SEE进行检测,对食品模拟样本的检测也有较好的灵敏度。结论:建立了检测SEE的AlphaLISA方法。该方法均相免洗,操作便捷,用时短,灵敏度更高,可对菌液上清和不同食品模拟样本中的SEE进行检测。     

DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区（N-端181aa）与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCT_RHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。     

用荧光图像示踪不同分化的食管癌细胞Cx43的空间分布

研究不同分化的食管癌细胞Cx43蛋白的表达和空间定位及其对食管癌细胞的生物学行为的影响。应用合适的荧光探针和激光扫描共聚焦显微镜,通过单粒子跟踪图像分析,检测Cx43蛋白荧光团在食管癌细胞中的表达和分布。Cx43在高分化食管鳞癌EC9706中的分布与EC109细胞相似,特别是细胞膜呈现明显的荧光团;近细胞膜Cx43蛋白含量相对细胞质增高,具有在细胞膜构建细胞通信的结构基础,预示着细胞向良性发展的趋势。低分化食管鳞癌KY150细胞和食管癌SHEEC细胞中Cx43蛋白的荧光团主要分布在近核膜的细胞质中,较少分布在细胞膜附近;近核膜的Cx43蛋白含量比近细胞膜的含量高,说明Cx43蛋白在细胞质中的滞留状态。研究显示SPT图像可以直观地示踪Cx43蛋白荧光团在食管癌细胞中的分布,从而确定Cx43蛋白在不同分化的食管癌细胞中表达及定位的痕迹。     

麻疹疑似病例血清学与病原学检测结果比较

目的分析麻疹疑似病例血清学和病原学的检测结果,比较两种检测方法,为麻疹的早期诊断提供实验室支持。方法同时采集2017-2018年北京市海淀区麻疹疑似病例的血清和咽拭子标本,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清中的麻疹IgM抗体,用荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测咽拭子标本中的麻疹病毒核酸。结果血清IgM抗体检测阳性率为11.54%,Real-time PCR法检测阳性率为44.23%,其检测阳性率显著高于血清检测阳性率,差异有统计学意义(χ~2=13.82,P0.01)。ELISA方法在出疹3 d内采集的阳性率为12.77%,Real-time PCR方法的阳性率为53.85%,差异有统计学意义(χ~2=16.70,P0.01);ELISA方法在出疹3 d后采集的阳性率为0.00%,Real-time PCR方法的阳性率为15.38%,二者比较差异无统计学意义(P0.05)。血清学检测敏感性为25.00%,病原学检测敏感性为95.83%,两种检测方法的阳性符合率为21.74%,阴性符合率为96.55%,总符合率为63.46%。ELISA和Real-time PCR法对有免疫史的病例检测阳性率分别为18.75%和37.50%,两种检测方法的阳性率差异无统计学意义(χ~2=1.39,P0.05);对无免疫史或免疫史不详病例检测的阳性率分别为8.30%和47.20%,两种检测方法的阳性率差异有统计学意义(χ~2=13.57,P0.01)。结论 Real-time PCR方法检测的阳性率和灵敏度均高于血清学检测方法,可以在日常检测工作中作为常规方法推广,无论采用哪种检测方法,应在出疹3 d内采集样本。     

应用实时荧光定量PCR技术分析玉米水分胁迫诱导基因的表达模式

应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术,研究了玉米中10个水分胁迫诱导基因的相对表达量及表达模式。结果表明,在花丝中,除基因Mads和Grp外,其他8个基因均随干旱胁迫程度加重,相对表达强度增加;在幼穗中,除基因Mads外,其他9个基因均随干旱胁迫程度加重,相对表达强度增加。应用实时荧光定量PCR和宏阵列技术的研究表明,在水分胁迫条件下,基因Arf3、Mads、Trx和F15相对表达量较高,可能在玉米应答水分胁迫过程起更重要的作用。     

Highly sensitive fluorescent-labeled probes and glass slide hybridization for the detection of plant RNA viruses and a viroid

In this study, a modified method of the conventional RNA dot-blot hybridization was established, by replacing ~(32)p labels with CY5 labels and replacing nylon membranes with positive-charged glass slides, for detecting plant RNA viruses and a viroid. The modified RNA dot-blot hybridization method was named glass slide hybridization. The optimum efficiency of RNA binding onto the surfaces of activated glass slide was achieved using aminosilane-coated glass slide as a solid matrix and 5×saline sodium citrate (SSC) as a spotting solution. Using a CY5-labeled DNA probe prepared through PCR amplification, the optimized glass slide hybridization could detect as little as 1.71 pg of tobacco mosaic virus (TMV) RNA. The sensitivity of the modified method was four times that of dot-blot hybridization on nylon membrane with a ~(32)P-labeled probe. The absence of false positive within the genus Potyvirus [potato virus A, potato virus Y (PVY) and zucchini yellow mosaic virus] showed that this method was highly specific. Furthermore, potato spindle tuber viroid (PSTVd) was also detected specifically. A test of 40 field potato samples showed that this method was equivalent to the conventional dot-blot hybridization for detecting PVY and PSTVd. To our knowledge, this is the first report of using dot-blot hybridization on glass slides with fluorescent-labeled probes for detecting plant RNA viruses and a viroid.     

免标记荧光适体传感器的研究进展

核酸适体在治疗、诊断和生物传感等领域都引起了强烈的关注和广泛的应用。与传统的识别元素-- 抗体相比较,适体展现 出很多的优点：尺寸小,化学性质稳定,容易制备和修饰。更重要的是适体在生物传感的设计上更为灵活,因此,产生了很多高选 择性、高灵敏度的新型适体传感器。目前,很多的检测手段都被应用到适体传感器中,其中荧光的检测手段占有重要的地位。虽然 荧光适体传感器已经取得了重大的进展,但是荧光标记给传感器的设计带来很多的不便,因此,免标记的荧光适体传感器备受关 注。在本文中,我们将对免标记的荧光适体传感器的研究进展进行综述,为分析工作者发展更加灵敏、更加简单、更加应用广泛的 免标记荧光适体传感器提供依据。     

PEI介导的大规模基因瞬时转染研究进展

基因重组蛋白具有巨大的商业和科研价值。近年来,大规模基因瞬时表达(large scale transient gene expression,TGE)技术的出现提供了一种相较于传统筛选稳定细胞株重组蛋白生产工艺而言更加高效(high efficient)和更加节约人力(labor consuming)、物力(cost effective)和时间(time consuming)的解决方案。通过基因瞬时表达技术,可以在短时间内获得毫克至克级别的在分子结构、理化特性和生物学功能等方面都接近于原始存在的蛋白质分子,可以满足细胞信号转导、新药筛选和临床前研究等药物研发前期的阶段对重组蛋白的巨大需求。因此,该技术成为当前研究的热点。阳离子聚合物-聚乙烯亚胺(PEI)是目前报道的工业化、大规模瞬时转染表达重组蛋白领域最广泛使用的基因载体和转染试剂。本文就近年来PEI介导的大规模瞬时转染的转染机理、宿主细胞选择以及转染优化措施等各方面的最新研究进展作一综述。     

甜菜夜蛾化学感受蛋白SexiCSP3结合特性分析

本研究构建夜蛾科昆虫化学感受蛋白系统进化树,发现化学感受蛋白在种间保守性强,并与气味结合蛋白明显分为两类。运用反转录RT-PCR方法克隆了Sexi CSP3基因,并在大肠杆菌中正确表达,重组Sexi CSP3蛋白纯化后通过荧光竞争结合实验测定其与24种外源气味分子的结合特性。结果表明:Sexi CSP3与苯甲醛、苯乙酮、2-戊基-3-苯丙基-烯醛、1-苯基-1-丁酮、对甲氧基苯甲醛的结合能力较强,解离常数为0.76、1.39、2.23、3.23和5.30μmol/L,推测Sexi CSP3可能参与了甜菜夜蛾对这5种化学物质的识别过程。     

研发动态

<正>中国农科院发现控制山羊产羔数关键基因中国农业科学院北京畜牧兽医研究所通过构建文库和测序的方法,在山羊下丘脑、垂体和卵巢组织中发现了一系列与山羊产羔数相关的重要基因,为利用分子育种方法提高山羊产羔数提供了新思路。该研究成果日前发表于《分子繁殖与发育》杂志上。研究人员表示,产羔数量是山羊产业发展的一个关键经济指标,这一指标是由多个器官多个基因共同控制的复杂过程,其遗传基础尚不十分清