细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

酵母表面展示-酶联免疫吸附测定法的建立

以表面展示人源蛋白酶体α亚基6蛋白的重组酵母细胞,结合酶联吸附免疫原理检测技术,以表面展示有人源蛋白酶体α亚基6(proteasome subunit alpha6,PSα6)的重组酵母细胞及其对应的单克隆抗体3D7D12D为研究对象,建立酵母酶联免疫吸附(yeast-ELISA)检测技术,应用于检测小鼠单克隆抗体及单抗效价.应用该方法最佳酵母浓度为0.50A600;测得单抗效价为1∶5×105,与常规ELISA效价接近;交叉试验和阻断试验表明该方法特异性强;同时该方法可用于检测抗血清.结果表明,yeast-ELISA可直接应用于检测单抗,测得效价与常规抗原包被间接ELISA具有良好一致性,特异性好,无交叉反应性.     

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.     

蜂毒素分子的改造及其基因在毕赤酵母中的表达

为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素,对蜂毒素的分子结构进行了改造。将第5位的Val变为Arg,第15位Ala变为Arg,删除了第16位的Leu。用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因,将其克隆入酵母表达载体pPICZa-A,获得重组表达质粒pPICZa-A-MEA。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导下表达,发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化,结果表明,蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达,经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低,经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29mg／ml。     

GFP-mTn融合蛋白对蓝猪耳生活细胞微丝骨架的标记

用农杆菌介导法将嵌合基因GFP-mTn(mTn是微丝结合蛋白Talin的微丝结合域,可以显示活体细胞中微丝的结构)导入蓝猪耳。经激光共聚焦显微镜观察了转基因植株的各种不同组织中融合蛋白的表达和分布情况。在叶片的表皮细胞、保卫细胞、根部的皮层细胞中有融合蛋白的不同程度表达。但仅在保卫细胞中微丝标记状况良好,显示基因表达的组织特异性。经光诱导处于开放态的气孔的保卫细胞微丝呈网状结构,在细胞内无规则分布;经黑暗诱导处于关闭态的气孔保卫细胞中微丝束沿保卫细胞纵轴排列,呈卷曲状分布,并观察到螺旋和环状的微丝结构。在转基因植株的其他部位,例如茎表皮细胞、根毛细胞和花粉粒中,未检测到目的基因的表达。本研究获得的转基因植株为研究气孔运动过程中微丝动态变化提供了有用的材料。     

四个嗜热真菌中国新记录种

报道四个嗜热真菌中国新记录种:嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus;埃默森篮状菌Talaromyces emersonii;杜邦青霉Penicillium dupontii及丝衣霉状拟青霉Paecilomyces byssochlamydioides,对其进行了描述和讨论。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达

将去除信号肽的猪干扰素-γ（PoIFN-γ）基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPIC9K-α-PoIFN-γ分泌型重组表达载体, 电转化导入毕赤酵母GS115中,经G418筛选后获得2株多拷贝插入的重组子。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,其表达量为108mg/L,占培养液总蛋白的60%。实验首次在毕赤酵母表达系统中实现了PoIFN-γ基因的分泌表达。     

利用酵母菌细胞转化肉桂酸生成L-苯丙氨酸

对利用酵母菌转化肉桂酸生成L-苯丙氨酸的方法进行了菌株筛选、菌体细胞培养、转化反应条件以及产物提取等方面的探索。从13个属的71株酵母菌中选到转化生成L-苯丙氨酸较高的粘红酵母(Rhodosorula glusinis)As 2.102菌株。经实验得出该菌株的最佳培养条件为:在含有1.5%酵母膏、1%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.05%L-苯丙氨酸、0.05% KH₂PO₄、0.5%NaCl、pH5.0的培养基中,30℃振荡培养20小时;最佳转化条件