引物悬挂延伸PCR扩增白藜芦醇合酶cDNA

为了得到葡萄白藜芦醇合酶(RS)基因的cDNA,实验以葡萄叶片为材料,利用引物悬挂延伸PCR法,以葡萄总DNA为模板,先分别扩增得到编码白藜芦醇合酶的第一外显子和第二外显子的序列,再以这两个序列为模板,进行第二轮的PCR,得到大小与RS基因大小相同的片段,经PCR产物测序证明,两个外显子已经准确无误地拼接,此片段就是RS基因。     

酶法提取葡萄穗轴中原花色素、白藜芦醇的研究

将纤维素酶用于葡萄穗轴中原花色素和白藜芦醇的提取工艺中.即在乙醇提取前,先用纤维素酶处理葡萄穗轴粗粉.通过实验确定最佳的酶解条件为:酶解体系pH 6,酶解温度30 ℃,酶解时间80 min,m(纤维素酶):m(葡萄穗轴粗粉)=1∶ 250.实验还对酶解后乙醇提取条件进行优化:40%乙醇溶液为提取剂,提取温度80 ℃,提取时间120 min.提取液通过溶剂萃取进行分离,用香草醛-盐酸法和紫外分光光度法分别测定其中原花色素和白藜芦醇的含量.与传统直接醇提法相比,原花色素的提取率提高了近4倍,白藜芦醇的提取率也有所提高.     

凝胶柱层析分离虎杖中白藜芦醇的研究

本论文初步探讨了虎杖中白藜芦醇分离纯化的工艺条件,比较了不同溶剂、不同浓度、不同流速洗脱条件下白藜芦醇样品在LH-20凝胶层析柱上的分离效果,以及虎杖的乙醇提取液通过氯仿、乙酸乙酯萃取,凝胶柱层析分离后的成分变化,实验表明,当以甲醇为洗脱液,浓度为60%,流速为0.5 mL/min时,白藜芦醇样品的分离效果最好.采用中压液相色谱检测收集到的白藜芦醇纯度(以白藜芦醇峰面积占总峰面积计算)可达80.34%,回收率达86.16%.     

农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的研究

目的:通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜,并对转化条件进行优化.方法:以蔓茎堇菜叶柄为受体材料,采用叶盘法进行遗传转化,实验过程中对影响转化的一些主要因素进行筛选研究.结果:最佳的侵染条件为OD6000.3的菌液侵染10min,头孢霉素的适宜浓度为250mg/L.转化后的蔓茎堇菜外植体经3.0mg/L潮霉素筛选,最终得到9株抗性再生苗,转化频率为0.98%.结论:该研究为建立一个农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的遗传体系提供了基础.     

毛脉酸模不同器官中几种生物活性物质的含量及生长季节对其的影响

为确定毛脉酸模(Rumex gmelini)最佳药用部位和最佳采收期,从而为新药源开发提供科学依据,我们采用HPLC法和梯度洗脱,研究了一年生和二年生毛脉酸模不同生长发育期、不同器官、组织中7种生物活性成分(白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄酚苷、酸模素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚)的动态分布规律.结果表明毛脉酸模根部含有生物活性成分的种类及含量均多于其他部位,为最佳药用部位.一年生毛脉酸模根部不含有酸模素.二年生毛脉酸模根部含有全部7种生物活性成分,且在8～9月份含量最高,为最佳采收期.     

花生白藜芦醇合酶基因cDNA的克隆及植物表达载体的构建

为得到含有白藜芦醇合酶cDNA(RS cDNA)并能表达白藜芦醇(Res)的转基因植物,以花生为材料,从其根部提取基因组DNA,并以其为模板,利用引物悬挂延伸PCR法扩增得到大小约1200bp的片段,将这个片段连接到克隆载体PBS-T上进行测序,测序结果证明,此片段就是花生的RS cDNA。将此片段再正向插入到植物表达载体PBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,对重组子进行筛选与鉴定,证明花生的RS cDNA已经正确插入PBI121中,成功的构建了植物表达载体PBI121L。     

bc1-2和bax及NF-kB在白藜芦醇诱导肝癌细胞凋亡中的作用

目的探讨白藜芦醇诱导肝癌细胞凋亡的途径.方法白藜芦醇体外处理HepG2肝癌细胞24 h后,以免疫组化检测凋亡调控基因bcl-2和bax及NF-kB的表达.结果白藜芦醇处理组HepG2细胞bcl-2的阳性积分和NF-kB的阳性细胞密度均明显低于对照组(P＜0.01);而bax阳性积分明显高于对照组(P＜0.01).结论白藜芦醇能下调HepG2细胞bcl-2基因的表达,上调bax的表达,同时抑制NF-kB的活化,这可能是其诱导HepG2细胞凋亡的途径之一.     

白藜芦醇苷通过抑制长链非编码RNA HULC表达抑制肝癌SMMC-7721和HepG2细胞的增殖和侵袭

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,目前仍在寻找有效的治疗手段。我们之前的研究证实白藜芦醇苷能够抑制肝癌细胞的增殖和侵袭,但其具体的分子生物学机制仍不清楚。本文主要探讨白藜芦醇苷调控肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2肝癌细胞系增殖能力的分子生物学机制。首先,我们构建大鼠原发性肝癌模型,发现模型组肝组织中长链非编码RNA HULC的表达较正常组明显升高;同时检测白藜芦醇苷预防组（分为低剂量组,中剂量组和高剂量组）肝组织中肝癌细胞中出现异常的高表达(HULC)的表达情况。结果显示,在中、高剂量组中HULC的表达明显降低。在体外实验中,SMMC7721和HepG2中HULC的表达明显较正常肝组织显著增高,然而白藜芦醇苷高剂量组中HULC的表达发生明显降低,同时在SMMC7721和HepG2中加入白藜芦醇苷后,高剂量组中细胞增殖能力明显下降。为了进一步探究HULC在白藜芦醇苷预防肝癌中的功能,我们构建了HULC过表达质粒以及针对HULC的siRNA片段,并验证了过表达和敲低的效率。在使用高剂量白藜芦醇苷处理SMMC7721和HepG2的同时,过表达HULC能够逆转白藜芦醇苷引起的对细胞增殖的抑制,然而敲低HULC则能够更加有效地降低白藜芦醇苷对细胞增殖的抑制效果。这提示我们白藜芦醇苷能够可能通过调控HULC的表达抑制肝癌细胞的增殖和侵袭,二者具有协同作用。本文结果为预防原发性肝癌提供了新的理论依据但其临床疗效还需要进一步验证。     

白藜芦醇苷通过抑制microRNA-21表达抑制肝癌细胞增殖和迁移

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,目前仍在寻找有效的治疗手段. 白藜芦醇苷可抑制肺癌细胞以及大肠癌细胞的增殖,但其在肝癌中的作用及具体作用机制并不清楚. 本文探讨白藜芦醇苷对大鼠肝癌是否具有预防作用,及其对肝癌细胞系增殖和侵袭的影响. 构建大鼠原发性肝癌模型,将其分为正常组、模型组及白藜芦醇苷预防组. 病理检测结果显示,与模型组相比,白藜芦醇苷预防组的肝癌发生率明显降低.检测肝组织中microRNA-21表达情况,结果显示,白藜芦醇苷预防组肝中microRNA-21表达明显降低,并且microRNA-21的靶基因PTEN表达上调.在肝癌细胞系SMMC7721和HepG2中加入白藜芦醇苷,细胞增殖及侵袭能力明显下降,同时伴随microRNA-21表达降低,PTEN表达升高. 这提示,白藜芦醇苷可能通过抑制microRNA-21的表达,抑制肝癌的发生,本文结果为预防原发性肝癌提供了新的理论依据,但其临床疗效还需要进一步验证.     

异源表达CiRS基因通过生成白藜芦醇增强拟南芥的抗氧化能力

白藜芦醇是一种具有多种医疗保健作用的植物芪类次生代谢产物,在农业、医药、食品和化妆品等领域受到广泛的关注。白藜芦醇合酶是白藜芦醇生物合成中唯一必需的关键酶,决定植物体内白藜芦醇的合成。将中间锦鸡儿中克隆到的CiRS基因(Gen Bank登录号MF678590)转入野生型拟南芥,实验结果显示:野生型的总黄酮含量明显高于转基因株系。HPLC测得转基因拟南芥中有白藜芦醇的生成,并且含量最高达335μg/g FW。紫外照射处理后转基因植物中丙二醛的积累量明显少于野生型。转基因植物提取物DPPH自由基清除能力均高于野生型。这些结果表明,中间锦鸡儿CiRS基因异源表达后利用与黄酮类物质的共同底物合成了白藜芦醇,使得转基因植物的抗氧化性增强。