超声波辅助农杆菌介导CP基因转化番小瓜(Carioca papaya L.)的有效方法

本研究探索了通过农杆菌介导,超声波辅助处理,转化番木瓜胚性愈伤组织,获得转基因植株的有效方法。分别将含有日本PLDMV 外壳蛋白基因(PTi-Epj-TL-PLDMV)和含有台湾PRSV 菌株、美国夏威夷PRSV 菌株、泰国PRSV 菌株及日本PLDMV 菌株的多元外壳蛋白基因编码序列(PTi-NP-YKT)插入双元载体质粒pGA482G,借助于农杆菌系LBA4404将双元载体上的外壳蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)转移到番木瓜品种Sunset 的胚性愈伤组织中,从而获得抗卡那霉素的转化再生植株。试验着重在转化方法上进行探索。结果表明,农杆菌过夜培养后,用高渗透压培养液(1/2 MS 6%蔗糖 1%葡萄糖,pH 5.7)调整至光密度OD_(600(?)m)=0.15-0.20,然后用该菌液感染材料30min,其间辅以超声波处理,可以大大提高转化效率。用15ml 无菌离心管装载胚性愈伤材料进行15s 的超声波处理,在80块被转化的胚性愈伤中获得21个CP 基因G 转化系(26.3%),而在对照处理64块胚性愈伤中仅获得1个转化系(1.6%);在经过15s 的超声波处理48块被转化的胚性愈伤中获得8个CP 基因B 转化系(16.7%),而在对照处理25块胚性愈伤中未出现转化系。上述操作方法用在两种CP 基因转化上均表现出相似的效果。试验还表明:120mg/L 是卡那霉素抗性筛选的最佳浓度。抗性筛选9个月后,在421块胚性愈伤组织中产生了42个抗卡那霉素的转化系。所获得的转基因植株分别用PCR 和Southern 印迹杂交进行了鉴定。     

中国链格孢属的分类研究 Ⅳ.生于夹竹桃科和番木瓜科植物上的新种和新变种(英文)

报道生于夹竹桃科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）植物上的链格孢新种２个、新变种２个,即络石链格孢（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉ　Ｔ．Ｙ　Ｚｈａｎｇ,Ｘ,Ｆ,Ｌｉｎ　ｅｔ　Ｗ．Ｑ．Ｃｈｅｎ）、细极链格孢络石生变种［Ａ．ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ（Ｎｅｅｓｅｘ　Ｆｒ．）Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅｖａｒ．ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｉｃｏｌａ　Ｔ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ,Ｘ．Ｆ．ＬｉｎｅｔＷ．Ｑ．Ｃｈｅｎ］、细极链格孢长春花变种［Ａ．ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ（ＮｅｅｓｅｘＦｒ．）Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅｖａｒ．ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉＴ,Ｙ．ＺｈａｎｇｅｔＸ．Ｆ．Ｌｉｎ］和长春花生链格孢（Ａ.ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉｃｏｌａＴ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ）,及生于番木瓜科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）植物上的番木瓜链格孢（Ａ．ｃａｒｉｃａｅ　Ｔ．Ｙ．Ｚｈａｎｇ,Ｗ．Ｑ．Ｃｈｅｎ　ｅｔ　Ｘ．Ｆ．Ｌｉｎ）．新种和新变种均有拉丁文特征描述,并附绘图．新分类单位的模式标本分别存放在西北农业大学真菌标本室（ＨＭＵＡＢＯ）和山东农业大学植物病理标本室（ＨＳＡＵＰ）．     

番木瓜环斑病毒检测技术的研究

本研究在37℃条件下,以硝酸纤维素滤膜(NCM)为载体:3％酪蛋白为封闭剂、辣根过氧化物酶标记的A蛋白为酶标结合物(SPA-HRP)和以稀释100倍兔抗PRV-Ys的IgG为其工作浓度,成功地建立了检测PRV的间接Dot-ELISA。其检测灵敏度达到了较满意的ng水平。同时,本研究以PRV-Ys株系RNA作模板、oligo(dT)~(12-18)作引物、pUC19作cDNA克隆载体和以E.coli JM107作受体,采用缺口翻译(Nick Translation)方法成功地制备了pYs6 cDNA分子探针(插入片段约300bp)。其检测PRV-RNA的灵敏度达到了较理想的pg水平。     

番木瓜基因型遗传关系的SRAP分析

利用SRAP标记对中国22个番木瓜主要栽培品种（系）进行亲缘关系和遗传多样性研究。结果表明:（1）筛选出的20对SRAP引物共扩增249条谱带,其中多态性条带110条,多态性比率为43.20%,平均每对引物扩增的条带数和多态性条带数分别为12.45条和5.50条。（2）引物多态性信息含量（PIC）值变化范围为0.15～0.79,平均值为0.49。（3）聚类分析和主坐标分析显示,供试材料间的遗传相似系数为0.72～0.96,遗传多样性水平较低,在相似性系数为0.87时,可将所有试材分为3个类群。该研究结果有效地揭示了中国番木瓜主要栽培品种（系）资源的遗传背景和亲缘关系,可为番木瓜种质资源的分类、保护和有效利用以及新品种选育提供理论依据。     

番木瓜中6个BG生物合成相关基因荧光定量分析

异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)是医学界公认的具有防癌抗癌活性的成分,对多种癌症具有很好的作用.BG是BITC的前体物质,可以在芥子酶的作用下水解生成BITC.研究表明,BG在热带水果番木瓜中含量丰富.本研究在克隆了番木瓜中6个相关基因和测定了BG在番木瓜不同组织中含量的基础上,采用实时荧光定量PCR技术,对6个基因在番木瓜不同组织中的表达量进行测定,并与BG的含量进行比较,考察其相关性.结果表明各基因的表达量相对较高时BG的含量也较高,即6个基因在番木瓜中的表达量与BG的含量存在相关性.我们推测,这6个基因可能是番木瓜中BG生物合成相关基因.本文结果为进一步研究基因的功能提供了理论依据.     

中国热带地区的半知菌Ⅰ.云南尾孢菌属及其近似属的种(英文)

本文报道云南热带地区尾孢菌属及其近似属真菌４５种,其中有一个新种：番木瓜短胖孢（ＣｅｒｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｐａｙａｅＹ．Ｌ．Ｇｕｏ,ｓｐ．ｎｏｖ．）,寄生在番木瓜科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）番木瓜（ＣａｒｉｃａｐａｐａｙａＬ．）叶上。短胖孢属真菌在番木瓜科植物上是首次报道。文中为新种提供了拉丁文简介、描述并附图。模式标本保藏在中国科学院微生物研究所真菌标本室（ＨＭＡＳ）。寄生在番木瓜（ＣａｒｉｃａｐａｐａｙａＬ．）上的ＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｍａｍａｏｎｉｓＶｉｅｇａｓ＆Ｃｈｕｐｐ与本种近似,二者都具有子座,分生孢子梗紧密簇生,但前者分生孢子梗（５～２５×２～３μｍ）和分生孢子（１０～４５×２～３μｍ）均短而窄。番木瓜尾孢（ＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｐａｐａｙａｅＨａｎｓｆ．）与本种的区别在于无子座,分生孢子梗色泽深（中度褐色）,分生孢子梗长（５０～２００×３．５～６μｍ）,分生孢子无色,针形,窄（２０～７５×３～５μｍ）。     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3''''端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性

【目的】明确云南省番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)发生情况,并对其进行遗传多样性分析。【方法】利用RT-PCR技术,于2011-2012年对采自云南省昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州、文山州等地的24个番木瓜、南瓜和罗汉果疑似病样进行扩增、测序,对样品中获得的940 bp PRSV部分cp基因及3′端非编码区的序列应用分子生物学软件MEGA 5进行系统发育分析。【结果】从17个样品中检测到了PRSV,检出率为70.8%,表明该病毒在云南的发生较为普遍。云南PRSV不同分离物间的核苷酸序列变异较大,与其他已报道的PRSV分离物之间的基因组3′端核苷酸序列一致性为81.7%-100%。基于PRSV的CP部分氨基酸序列及基因组3′端核苷酸的系统进化分析结果表明,来自亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲的PRSV分离物可以分为2个组,其中第Ⅰ组均为来自中国的分离物,包括了大部分的PRSV云南分离物,第Ⅰ组内分离物间的差异较第Ⅱ组大;第Ⅱ组的分离物来源较为复杂,亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲均有分布。基于PRSV CP部分氨基酸序列构建的系统进化树中,各分离物之间没有明显的地理和寄主相关性,而基于PRSV基因组3′端核苷酸序列构建的系统进化树中,除中国大陆分离物和印度分离物外,其他地区的PRSV在进化上与其地理来源有明显的相关性。【结论】PRSV在云南的昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州和文山州等地都有不同程度发生,且为害寄主植物涉及番木瓜、南瓜及罗汉果,PRSV侵染罗汉果为云南首次发现。云南PRSV分离物的分子变异很大,但是关于PRSV的分子变异是否与其地理分布及症状表现有关,以及P型和W型的分子区分特征还有待进一步研究。     

中国热带地区的半知菌I.云南尾孢菌属及其近似属的种

本文报道云南热带地区尾孢菌属及其近似属真菌45种,其中有一个新种：番木瓜短胖孢(Cercosporidium papayae Y．L Guo,sp．nov．),寄生在番木瓜科(Caricaceae)番木瓜(Carica papaya L)叶上。短胖孢属真菌在番木瓜科植物上是首次报道。文中为新种提供了拉丁文简介、描述并附图。模式标本保藏在中国科学院微生物研究所真菌标本室(HMAS)。寄生在番木瓜(Carica papaya L)上的Cercospora mamaonis Vicgas ＆ Chupp与本种近似,二者都具有子座。分生孢子梗紧密簇生,但前者分生孢子梗(5～25×2～3μm)和分生孢子(10～45×2～3μm)均短而窄。番木瓜尾孢(Cercospora papayae Hansf.)与本种的区别在于无子座,分生孢子梗色泽深(中度褐色),分生孢子梗长(50～200×3.5～6μm),分生孢子无色,针形,窄(20～75×3～5μm)。