链霉菌质粒pSET152电转化稀有放线菌小单孢菌的研究

利用链霉菌(Streptomyces)噬菌体ΦC31所构建的整合型载体pSET152作为供体质粒,分别以小单孢菌(Micromonospora)40027菌株的萌发孢子和新鲜菌丝体作为受体菌,在不同的电场强度下进行电转化实验,结果表明:以小单孢菌40027菌株萌发孢子为受体菌,未获得电转化子;以小单孢菌40027菌株新鲜菌丝体为受体菌,获得了电转化子。电场强度为13kV/cm时可获得最高转化效率。Southern杂交结果表明:质粒pSET152可通过菌丝体电转化法导入小单孢菌40027菌株,并整合到小单孢菌40027菌株的染色体上,暗示链霉菌噬菌体ΦC31的整合酶基因和整合位点在异源宿主小单孢菌40027菌株中仍具有相同的功能。质粒稳定性检测实验表明:质粒pSET152可稳定地存在于小单孢菌40027菌株中。     

适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法

根据最近文献报道的方法,以基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032为宿主,采用E.coli-C.glutamicum穿梭质粒pC2以及可以整合到谷氨酸棒杆菌基因组DNA上的质粒pAK进行电转化条件优化的实验,建立了一种简便的,适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化方法。建立的新方法与原方法相比,细胞预培养时间缩短4h,细胞培养时间缩短1d左右。细胞培养基被简化,不再需要添加进口生化试剂。转化率可达5.5×106cfu／μgDNA,是一种适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法。     

响应面法优化嗜热链球菌AR333电转化条件

【背景】嗜热链球菌AR333是本实验室从发酵乳中筛选出的一株高产活性胞外多糖乳酸菌。【目的】建立嗜热链球菌AR333高效电转化体系。【方法】通过单因素试验和Box-Behnken响应面法优化电转化条件。【结果】嗜热链球菌AR333最优电转化条件为甘氨酸浓度8.3g/L,OD_(600)为0.8,10%甘油(体积比)和0.5 mol/L蔗糖的电转缓冲液,pIB184质粒80 ng,电场强度14 kV/cm,0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl_2和20 mmol/L MgCl_2的LM17复苏培养基,复苏时间5 h。【结论】在最优电转化条件下,嗜热链球菌AR333电转化效率达到3.68×10~5 CFU/μg-DNA,比优化前提高了14倍,实现了嗜热链球菌AR333的高效遗传转化,为其功能解析和基因工程改造奠定基础。     

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

构建噬菌体展示抗体库过程中电穿孔法的条件优化

目的：确定稳定且高效的电转化实验方案以达到构建高库容噬菌体展示抗体库的目的。方法：探索电压、脉冲时间、噬菌粒DNA质量与浓度、TG1大肠杆菌的生长周期、重悬洗涤缓冲液及培养基优化等方面对TG1大肠杆菌电转化效率的影响。结果：当电转杯电极间距为2mm时,设定电转仪参数为3kV、25μF、5ms、200Ω;外源DNA经纯化后加入感受态菌液中使终浓度为1ng/μl;培养基中加入20mmol/L的MgCl₂,并将TG1的生长阶段调控在OD₆₀₀=0.8,用无菌超纯水重悬及洗涤细胞,将感受态细胞浓度调整为4×10¹⁰个/ml。在上述条件下,电转化效率可达到4.9×10⁹CFU/μg DNA。结论：通过多种条件优化,提高了电转化效率,为构建高库容噬菌体展示抗体库建立了基础。     

刺糖多孢菌电转化条件研究

以经理化诱变选育的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)CB11为受体菌,将具有安普霉素(apramycin)抗性标记的整合型载体pSET152作为质粒供体,研究了制备刺糖多孢菌感受态细胞时菌体的生长阶段、质粒DNA浓度、电场强度等因素对电转化效率的影响,结果表明,在菌体培养4...     

一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的选育及发酵条件优化

以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株,经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛选,获得一株L-脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明,葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用量分别为16%、300μg/L、400μg/L,最适pH为6.8~7.0,装液量为25ml/500ml摇瓶,发酵培养72h后L-脯氨酸产率高达到75.6g/L,与对照相比提高了5%。考察了50L发酵罐中细胞生长对L-脯氨酸产量的影响,补料分批发酵结果表明(比生长速率分别为0.06/h、0.08/h和0.1/h),比生长速率在0.08/h左右时L-脯氨酸的产率最高,L-脯氨酸的比生产速率Q_P达到0.091 g/(g.h),产率高达82.1 g/L,比优化前提高了14%。     

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因 (去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析：双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60％硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和 HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫（Helicourpa armigora）具有高效杀虫活性,其3d LC₅₀值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。     

地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成及高效电转化

芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿状态下,细胞易产生感受态因子,处于生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生感受态。基于此原则利用芽孢杆菌极限营养培养基通过体外处理诱导使地衣芽孢杆菌产生感受态性能,同时调整参数,建立了感受态细胞对质粒pAPR的高效电转化方法。当质粒DNA浓度为1．5μg/ml、转化时电压为1750V的时候,可以得到261个转化子,经鉴定均为阳性克隆子。而常规电转化的最高仅为20个转化子。为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化提供了模型,也为建立适合工业应用的分泌型表达载体的构建打下了一定基础。