假单胞菌株M18 gacA基因的克隆、表达及蛋白纯化

GacA是GacS/A双元调控系统的一个组分, 克隆假单胞菌株M18中的gacA基因。测序结果同Pseudomonas sp. PAO1比较, 该基因2个碱基的改变未引起氨基酸的改变。将该基因克隆到表达质粒pET28b (+)中, 将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中, IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化, 蛋白纯度约为98%, 质谱鉴定证明纯化的蛋白为GacA蛋白。CD谱分析GacA包含了4% α-helix, 48% β-sheet 和48%无规则卷曲。GacA蛋白的获得为进一步研究其晶体结构、生物学性能以及GacS/A双元调控系统奠定了基础。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

草菇MAPKKK同源基因的克隆及序列分析

根据担子菌丝裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(MAPKKK)蛋白的保守序列设计两对简并引物,通过巢式简并PCR方法获得草菇VV-MAPKKK基因中的保守片段,然后通过和草菇基因组信息比对,获得了VV-MAPKKK基因全长序列。VV-MAPKKK基因长度为4434bp,包含4个内含子,编码1405个氨基酸残基,推定的氨基酸序列与新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)和异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)的MAPKKK同源蛋白相似性分别为58%、57%和56%。对VV-MAPKKK蛋白的系统发生学分析的结果表明,VV-MAPKKK与担子菌中的Hog信号传导途径的MAPKKK同源蛋白聚在同一进化支上,这些数据都支持所获得的VV-MAPKKK为Hog-MAPKKK蛋白在草菇中的同源物的推定。     

综合应用ITS及16S rDNA进行环境微生物生态研究*

提出并介绍一种研究微生物生态的新方法。该方法将克隆测序和RISA图谱技术有机结合。其技术关键是：PCR扩增的目标片段包含全长ITS和部分16SrDNA片段,既可利用16SrDNA进行系统发育分析,又可测定ITS片段大小并与RISA图谱进行比对定位。分析过程简单经济,易于操作,普通分子生物实验室即可实现。     

缙云山不同生境蝴蝶花(Iris japonica Thumb.)分株种群格局及对草本多样性的影响

运用空间格局、生态位及多样性分析,探讨了重庆缙云山自然保护区林缘旷地(OAFE)、竹林(BF)及常绿阔叶林(EBF)3类生境蝴蝶花(Iris japonica Thumb.)自然种群分株格局特征及对草本多样性的影响机制.结果表明:方差均值比(V/m)和Moristia指数(Iδ)的格局判别分析表明,3类生境中蝴蝶花分株种群从0.5 m×0.5 m至2 m×2 m尺度均为聚集分布;从林缘旷地-竹林-常绿阔叶林,种群分株密度逐渐降低,总体格局规模与格局强度(PI)在各尺度均呈下降趋势.林缘旷地与竹林生境中,蝴蝶花的分布,降低了原优势种的优势度,并显著降低草本层物种多样性(p<0.05),但在常绿阔叶林生境中对原优势种的优势度及草本物种多样性的影响很小.不同生境中蝴蝶花种群格局对草本多样性的影响机制各不相同:林缘旷地生境,通过强的更新生态位(地上空间与根生态位)与营养生态位(获取水分与养分资源)竞争,降低草本物种丰富度尤其是偶见种丰富度;竹林生境,通过更新生态位(根生态位)与营养生态位(获取光与养分资源)竞争,降低了草本偶见种丰富度;常绿阔叶林生境,物种间生态位重叠较低,表现一定的资源竞争,但对草本多样性影响很小.林冠决定蝴蝶花分株种群格局强度、克隆生长的强弱及林下土壤状况,从而影响蝴蝶花与草本层其它物种之间生态位竞争的强弱是决定蝴蝶花种群对草本层物种多样性影响机制的重要因素.     

草木樨状黄芪变异系中甲硫氨酸代谢相关cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用mRNA差异显示技术(differential display)从草木樨状黄芪耐甲硫氨酸变异系中分离到一差异cDNA片段,命名为tm03(360bp)。mRNA杂交结果显示,该片段只在变异苗中表达,初步确定其与甲硫氨酸代谢相关。测序后在Genebank搜寻,未发现有同源序列。进一步分析表明,该cDNA克隆可编码完整的蛋白。在该基因片段两端分别合成含HindⅡ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pRSET A表达载体,转化宿主菌JMl09(DE3),经IPTG诱导表达了N′端含6个组氨酸的蛋白质,分子量约为14kD,为进一步研究该蛋白的结构和生物学功能奠定基础。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

XBP-1转录激活系统的构建

人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB／ATF(cAMP应答元件结合蛋白／激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Westem印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-IS的活性约是空载体的3倍。成功构建了xBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBp-1在各种疾病中的作用奠定了基础。     

Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV)UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。     

岷江干旱河谷小马鞍羊蹄甲根围丛枝菌根真菌群落的研究

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）在促进植物生长及土壤改良等方面的积极作用使其在退化生态系统的植被重建过程中发挥着关键作用。本研究采用建立克隆文库及测序的分子方法对四川省岷江干旱河谷乡土优势灌木小马鞍羊蹄甲Bauhinia faberi var. microphylla根围AMF的群落组成进行了探讨,以期为该地区乡土植被的保存与恢复提供理论依据。本研究中共检测到53个AMF类群（OTUs）,通过系统发育分析,将其划分为球囊菌门Glomeromycota的7科10属。Glomus、Diversispora与Funneliformis 3个属为小马鞍羊蹄甲根围土壤中的优势属,其中Glomus具有最高多度,其序列数及OTUs数均占总数的50%以上;Rhizophagus与Archaeospora为稀有属,其余各属为常见属。本研究表明,自然条件下研究区优势灌木小马鞍羊蹄甲根围具有相对丰富的AMF类群,同时也反映了AMF在干旱河谷区可能发挥着重要的生态功能。