细纹豆芫菁3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi (Maklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列, 命名为EmHMGR（GenBank登录号为JQ690539）。该基因全长3 118 bp, 其中5′端非翻译区178 bp, 3′端非翻译区414 bp, 开放阅读框2 526 bp, 编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8 kDa, 理论等电点为6.0, 预测分子式为C₄₁₃₅H₆₆₀₄N1₀₉₈O₁₂₁₆S₅₀, 不稳定系数为43.37, 总亲水性系数为0.091, 为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上, 而且包含HMGR_Class I保守功能域、 固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因, 为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。     

在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯

以青蒿素为基础的联合药物疗法 (ACTs) 被认为是目前治疗恶性疟疾的最有效方法。然而青蒿素供应不足且价格昂贵,限制了ACTs的广泛使用。采用基因工程手段构建异源类异戊二烯生物合成途径,利用大肠杆菌发酵能高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯。首先在大肠杆菌Escherichia coli DHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因,利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸,成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给,引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径,紫穗槐-4,11-二烯的产量提高了13     

巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中MVA和MEP代谢途径基因的表达分析

MVA和MEP代谢途径是植物类异戊二烯代谢途径的两条重要次生代谢途径。该研究利用荧光定量PCR技术,分析了橡胶树胶乳和橡胶树花药愈伤组织来源的悬浮细胞中MVA代谢途径和MEP代谢途径中关键基因的表达水平,同时分析了茉莉酸的结构类似物冠菌素(coronatine,COR)对悬浮细胞中Hb AACT3,Hb HMGR4,Hb HMGR5,Hb DXS2,Hb DXR和Hb SQS1基因表达的调节作用。结果表明:在MVA代谢途径中,基因Hb AACT1,Hb AACT2,Hb HMGS1,Hb HMGS2,Hb HMGR1,Hb HMGR3,Hb MVK,Hb PMK,Hb MVD1,Hb MVD2和IPP下游代谢基因Hb IPPI1和Hb FDPS1在胶乳中的表达量要相对高于其在悬浮细胞中的表达量,然而橡胶树悬浮细胞中MEP代谢途径基因Hb DXS1,Hb DXS2,Hb DXR,Hb CMS1,Hb CMS2,Hb CMK,Hb MCS1,Hb MCS2,Hb HDS,Hb HDR和鲨烯合酶基因Hb SQS1的表达水平要相对高于胶乳。而且COR能不同程度地上调Hb HMGR5,Hb HMGR4,Hb SQS1,Hb DXS2和Hb DXR基因的表达水平。该研究结果为探索利用橡胶树悬浮细胞体系研究次生代谢合成调控以及生产活性次生代谢产物奠定了基础。     

红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析

近几年的研究表明,非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径,通过对各种不同来源的非甲羟戊酸途径关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)基因同源区域进行比较,设计出简并引物,利用RT-PCR技术从中国红豆杉(Taxus chinensis)悬浮细胞中扩增出535bp的基因片段。同源序列比对发现,推断的蛋白质序列与Arabidopsis thaliana(Q9XFS9)、Mentha x piperita(Q9XES0)、Synechococcus elongatus(Q8DK30)、synechocystis sp．PCC 6803(Q55663)、Nostoc sp．PCC7120(QSYP49)、Synechococcus leopoliensis(Q9RKT1)的一致性分别达到95％、94％、80％、78％、78％和73％。结合蛋白质保守区、特征区以及进化树分析,证实该基因确为dxr基因,首次报道从裸子植物中克隆到非甲羟戊酸途径关键酶的基因片段。