假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

鲤源产β-甘露聚糖酶Bacillus velezensis HF-14109的分离鉴定及其酶学和生物学特性研究

【目的】以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌。【方法】采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价。【结果】本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强。通过形态学观察、生理生化试验、16Sr RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45°C、最适p H为6.0,在温度20–80°C、p H 4.0–9.0范围内都较为稳定;Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶具有激活作用,而Mn²⁺、Ca²⁺对该酶具有抑制作...     

黑曲霉固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶

以黑曲霉WA301为生产菌固态发酵生产酸性β－甘露聚糖酶,较适的培养基组成和培养条件为：麸皮10g,魔芋粉0.4g,豆饼粉1.5g,硫酸铵0.2g,起始湿度55％,pH自然,发酵温度35℃,发酵周期约96h。在此条件下,WA301的酸性β－甘露聚糖酶产率为950U／g干曲左右。     

不同类群酵母胞壁甘露聚糖核磁共振氢谱的比较研究

运用核磁共振氢谱(PMR谱)~(**)对各类酵母的细胞壁甘露聚糖进行比较研究,在我国尚无报道,其中某些酵母也尚无文献记载。本文结果表明:1.同菌株的胞壁甘露聚糖PMR谱型的重复性很好。2.同种不同株的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的多糖谱型也相同。3.所测的二端芽殖酵母中完全型与不完全型菌株的谱型很相似,如柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)与葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum。4.某些分类系统上来源较杂的子囊菌酵母如单宁管囊酵母(Packysolen tanophilus)、萤光威克酵母(Wickerhamiaflurescens)与高糖固囊酵母(Citeromyces matritensis)则体现了各不相同的谱型。5.二株分自西双版纳的极为相近的类酵母(Saccharomycodes sp.)其多糖的(PMR)谱型与多糖的组分都彼此相同,有助于对它们的适当归类。这一切证明酵母胞壁多糖PMR谱型相似程度的比较是分类上较有意义的性状,有助于探讨亲缘关系,核实完全型与不完全型,也有助于对疑难菌株的分析     

球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析

【目的】克隆与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的高渗适应性相关基因,并对其功能进行分析,以揭示球孢白僵菌对高渗等逆境适应的分子机理。【方法】利用YADE法克隆T-DNA的侧翼序列并进行基因组步行,获得突变基因的全长及上游序列;利用RT-PCR技术分析突变基因的表达特性以及与Bbhog1的关系;采用同源重组技术敲除Bbmpd基因。【结果】克隆得到插入突变基因及其上、下游序列全长3037bp。该基因与编码球孢白僵菌的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因相似性为98%。Bbmpd的表达受高渗环境(0.8mol/L NaCl)的诱导,受Bbhog1信号途径的激活调节,Bbhog1缺失导致Bbmpd表达下调。Bbmpd缺失突变体在高渗胁迫下的生长受到明显抑制。Bbmpd缺失不影响球孢白僵菌在查氏培养基上的生长和产孢。【结论】由T-DNA突变体克隆了编码球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因Bbmpd,该基因的表达受高渗环境的诱导和Bbhog1的调控,与球孢白僵菌高渗适应性相关。     

国产血清半乳甘露聚糖检测试剂对侵袭性肺曲霉菌病的诊断价值评估

目的：评估国产血清半乳甘露聚糖（Galactomannan,GM）检测试剂对侵袭性肺曲霉菌病的诊断价值。方法根据血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌病的诊断标准与治疗原则（第四次修订版）[1]收集临床确诊侵袭性肺曲霉菌病（inva-sive pulmonary aspergillosis,IPA）、临床诊断IPA、拟诊IPA、排除IPA四组病例。采用天津贻诺琦公司酶联免疫吸附法（ELISA）试剂检测纳入的86例患者血清标本的GM浓度,分析其敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）。结果86例病例中,临床诊断27例、拟诊12例、排除47例。在3种不同的阳性判断标准下,敏感性：9444%、9630%、6296%;特异性：5625%、4576%、6441%;PPV：4474%、4483%、4474%;NPV：9643%、9643%、7917%。统计学分析证实标准1（即血清GM值〉095μg/L为阳性,〈075μg/L为阴性,075~095μg/L为灰区,未将灰区加入计算）在3种判断标准中最优,故选择其为最终判断标准。结论该血清GM检测试剂盒诊断性能较好,可以用于侵袭性肺曲霉菌病的辅助诊断。     

β－甘露聚糖酶酶解植物胶及其产物对双歧杆菌的促生长作用

由地衣芽孢杆菌ＮＫ－２７获得的β－甘露聚糖酶在４０℃、酶液终浓度１ｕ／ｍｌ时,经１２ｈ水解魔芋粉、角豆胶、瓜儿豆胶和田菁胶所生成的酶解产物,经薄层层析检测表明为单糖和低聚糖。在ＰＹＧ和ＧＡＭ液体培养基中,添加不同量的四种植物胶酶解产物对青春双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅ－ｓｃｅｎｔｉｓ）具有明显的促生长作用,菌体增殖数从１０^７提高到１０^８个／ｍｌ。     

不同类群酵母胞壁甘露聚糖核磁共振氢谱的比较研究*

运用核磁共振氢谱(PMR谱) 对各类酵母的细胞壁甘露聚糖进行比较研究,在我国尚无报道,其中某些酵母也尚无文献记载。本文结果表明：1．同菌株的胞壁甘露聚糖PMR谱型的重复性很好。2．同种不同株的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的多糖谱型也相同。3．所测的二端芽殖酵母中完全型与不完全型菌株的谱型很相似, 如柠檬形克勒克酵母(Kloeokera apiculata)与葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum。4．某些分类系统上来源较杂的子囊菌酵母如单宁管囊酵母(Packysolen tanophilus)、萤光威克酵母(Wickerkamiaflurescens) 与高糖固囊酵母(Citeromyses matritensis) 则体现了各不相同的谱型。 5．二株分自西双版纳的极为相近的类酵母(Saccharomycodes sp.)其多糖的(PMR)谱型与多糖的组分都彼此相同,有助于对它们的适当归类。这一切证明酵母胞壁多糖PMR谱型相似程度的比较是分类上较有意义的性状,有助于探讨亲缘关系,核实完全型与不完全型,也有助于对疑难菌株的分析     

曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体,并基于获得的抗体建立用于快速准确检测曲霉菌感染的双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),以期可用于侵袭性曲霉菌病的临床诊断。方法:提取曲霉菌半乳甘露聚糖后免疫BALB/c小鼠,筛选与制备抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体,通过间接ELISA法与Western Blot方法开展单克隆抗体检测性能分析,使用获得的单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA方法,并初步应用于曲霉菌感染血清检测。结果:获得抗曲霉菌半乳甘露聚糖单克隆抗体5株,均可特异性识别曲霉菌半乳甘露聚糖,以其中性能最佳的3C9抗体和辣根过氧化物酶标记的3C9抗体配对为基础,建立了双抗体夹心ELISA方法,通过初步评价确定该方法可应用于临床侵袭性曲霉菌病血清检测,并且该方法与现有商品化试剂盒相比检测背景值较低,可更有效区分曲霉菌感染阴阳性血清。结论:本研究筛选获得针对曲霉菌半乳甘露聚糖的特异性单克隆抗体,以该抗体为基础建立双抗体夹心ELISA方法具有潜在转化应用前景,可为侵袭性曲霉菌病的临床诊断提供支持。     

β－甘露聚糖酶酶解植物胶及其产物对双歧杆菌的促生长作用

由地衣芽孢杆菌ＮＫ－２７获得的β－甘露聚糖酶在４０℃、酶液终浓度１ｕ／ｍｌ时,经１２ｈ水解魔芋粉、角豆胶、瓜儿豆胶和田菁胶所生成的酶解产物,经薄层层析检测表明为单糖和低聚糖。在ＰＹＧ和ＧＡＭ液体培养基中,添加不同量的四种植物胶酶解产物对青春双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅ－ｓｃｅｎｔｉｓ）具有明显的促生长作用,菌体增殖数从１０￣７提高到１０￣８个／ｍｌ。