诺卡氏菌形放线菌β-甘露聚糖酶的化学修饰及活性中心的研究

分别用 PCMB、NEM、N- AI、NBS等对诺卡氏菌形放线菌β- D-甘露聚糖酶进行化学修饰 ,证明蛋白上的巯基、酪氨酸残基及色氨酸残基是维持酶活性的必需基团 .在加入少量底物后 ,β- D-甘露聚糖酶的最大荧光发射峰从天然状态下的 336nm处蓝移至 332 nm,且峰强度有所增大 .这表明其色氨酸残基隐藏在蛋白内部的疏水区域 .通过对该酶圆二色性扫描光谱的分析 ,表明蛋白内部有二硫键的存在 ;通过巯基乙醇化学修饰的研究 ,表明二硫键是影响该酶热稳定性的一个重要因素 .在蛋白的各种二级结构中 ,α-螺旋、β-折叠、β-转角、自由卷曲的比例分别为 1 6.6%、2 5.4%、2 0 .5%和 37.5% .     

分枝杆菌脂聚糖的分离、纯化及其结构和功能分析

【目的】建立分离、纯化分枝杆菌脂聚糖的方法,初步比较分析不同菌株来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)的结构差异及研究脂聚糖刺激对巨噬细胞环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达的影响。【方法】应用Triton X-114液相法提取脂聚糖,电洗脱法分离纯化,基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行分子量鉴定;基于特异性识别非还原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新诺分枝杆菌JDM601、结核分枝杆菌H37Rv标准株和耻垢分枝杆菌mc2155脂聚糖的结构差异;进一步用Western blot检测脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结果】通过电洗脱法成功纯化出3种菌株脂聚糖;MALDI-TOF/TOF-MS鉴定发现,分子量从小到大依次为新诺分枝杆菌JDM601、耻垢分枝杆菌mc2155和结核分枝杆菌H37Rv来源的脂聚糖。Western blot显示,Con A能与结核分枝杆菌H37Rv标准株来源的LAM相互作用,而不能与新诺分枝杆菌JDM601和耻垢分枝杆菌来源的LAM相互作用;并且发现Con A与新诺分枝杆菌JDM601来源的LM有很强的反应,然而与其余两种来源的LM反应很弱。3种菌株来源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结论】首次成功对来源于中国临床分枝杆菌分离株的脂聚糖进行了分离纯化,初步探讨了不同菌株来源分枝杆菌脂聚糖的结构差异,并表明LAM和LM均能刺激巨噬细胞诱导COX-2蛋白的表达,为进一步研究其对宿主的毒力和免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖尿检用于儿童结核病诊断的研究进展

结核病(tuberculosis, TB),特别是儿童结核病,仍是影响全球健康的重要因素。由于传统的结核病诊断技术灵敏度、特异度较差,结核病病例常因为无法得到准确、及时的诊断而被延误治疗。儿童结核病病灶含菌量低,且患儿常无法咳出痰,因此,儿童结核病诊断较成人结核病诊断更具有挑战性。脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan, LAM)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)细胞壁上的特异性抗原,可以在结核患者的尿液标本中检测到,尿LAM检测有助于快速、准确地诊断结核病。本综述旨在总结LAM检测用于儿童结核病诊断的研究进展。     

黑曲霉固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶

以黑曲霉WA301为生产菌固态发酵生产酸性β－甘露聚糖酶,较适的培养基组成和培养条件为：麸皮10g,魔芋粉0.4g,豆饼粉1.5g,硫酸铵0.2g,起始湿度55％,pH自然,发酵温度35℃,发酵周期约96h。在此条件下,WA301的酸性β－甘露聚糖酶产率为950U／g干曲左右。     

鲤源产β-甘露聚糖酶Bacillus velezensis HF-14109的分离鉴定及其酶学和生物学特性研究

【目的】以黄河鲤为材料,从其肠道内分离具有产β-甘露聚糖酶功能的益生菌。【方法】采用平板水解圈法初筛,摇瓶发酵法复筛获得产β-甘露聚糖酶的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S r RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,并用DNS定糖法测定酶学活性,用耐高温、耐酸、耐胆盐和平板打孔扩散法对其益生特性进行研究,用滤纸片法、腹腔注射法等对其生物安全性进行评价。【结果】本研究通过刚果红染色从鲤肠道中分离筛选出产β-甘露聚糖酶的细菌62株,其中HF-14109菌株产酶能力最强。通过形态学观察、生理生化试验、16Sr RNA基因序列和比较基因组分析对该菌株进行鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为45°C、最适p H为6.0,在温度20–80°C、p H 4.0–9.0范围内都较为稳定;Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ba²⁺对该酶具有激活作用,而Mn²⁺、Ca²⁺对该酶具有抑制作...     

β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达

目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。     

β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因在大肠杆菌中共表达

【目的】β-甘露聚糖酶和木聚糖酶都属于半纤维素酶,它们已经同时运用于工农业生产的许多领域。构建β-甘露聚糖酶和木聚糖酶共表达菌株并进行相关评价。【方法】通过设计一个共同的酶切位点,将菌株Bacillus subtilis BE-91中的β-甘露聚糖酶和木聚糖酶基因串联到表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌构建了一株能够共表达β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的菌株B.pET28a-man-xyl。【结果】菌株诱导21 h后,发酵液中β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别为713.34 U/mL和1455.83 U/mL,是胞内酶活的11.8倍和2.53倍。【结论】SDS-PAGE分析、水解圈活性检测和胞外酶与胞内酶酶活检测表明:两个酶均以功能蛋白独立分泌到胞外。此外,与β-甘露聚糖酶和木聚糖酶单独酶解半纤维素相比,复合酶的酶解效果更好。菌株的成功构建为复合酶制剂(半纤维素酶制剂)的研究和生产奠定基础。     

低分子质量魔芋甘露寡糖的长期毒性与遗传毒性研究

魔芋甘露寡糖是一种具有肠道菌群调节作用的新型食品添加剂．本研究首次通过酶解与有机溶剂沉淀法制备了低分子质量的甘露寡糖(聚合度2～7),并对这类寡糖进行了长期毒性与遗传毒性评价．在长期毒性试验中,以大鼠为实验对象,分低、中、高(2.25,5.25,7.50 g/kg)药物剂量组和阴性对照组,连续灌胃给药90天．一般状况观察、生化指标、血液学指标、病理学等与对照组比较均无显著性差异,而大体解剖观察发现,部分大鼠的肝脏与肾脏形态发生变化,但这些变化均在正常范围内,且其他各项指标差异均无统计学意义．此外,一系列实验包括小鼠骨髓微核实验、Ames试验、小鼠精子畸变试验均未发现低分子质量甘露寡糖有明显的遗传毒性．试验结果提示,本研究方法获得的低分子质量甘露寡糖在本实验条件下未发现长期毒性与遗传毒性．     

芽胞杆菌苎麻脱胶酶-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质

研究了苎麻高效脱胶菌株Bacillus subtilisNo.16A甘露聚糖酶的产生条件,纯化过程以及酶学性质。其优化的培养基为魔芋胶30 g/L,蛋白胨9 g/L,酵母膏2 g/L,KH2PO45 g/L,MgSO4.7H2O 0.25 g/L。优化的培养条件为起始pH 8.0,装样量50 mL,接种量10 mL,发酵72 h。进一步通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤3步从Bacillus subtilisNo.16A发酵液中纯化了甘露聚糖酶。结果表明,该酶分子量约为38.5ku,最适作用pH为7.0,最适作用温度为60℃,在55℃以下、中性pH(6.0~8.0)范围内稳定,Ca2 、Mn2 和A l3 、Mg2 对该酶有激活作用,Cu2 、Zn2 有抑制作用。     

甘露寡糖对断奶仔猪肠道主要菌群的影响

选择健康的 35日龄断奶仔猪 4 8头 ,随机分为两组 ,每组 3圈 ,每圈 8头。一组为含 0 .5 %甘露寡糠 +基础日粮 ,另一组为基础日粮。试验开始第 7天 ,每组各随机选 6头仔猪 ,麻醉后剖腹取肠道内容物以测定盲肠和结肠大肠杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌浓度和 p H。试验结果表明 ,与对照组相比 ,甘露寡糖可以显著降低盲肠、结肠大肠杆菌浓度 (P<0 .0 5 ) ;同时显著提高盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌浓度 (P<0 .0 5 ) ,但对结肠乳酸杆菌和双歧杆菌数影响不显著 (P>0 .0 5 )