安徽恒河猴的微生物学和寄生虫学检测

对安徽省实验猕猴中心的安徽恒河猴进行了微生物（包括病毒和病原菌）和寄生虫检测。对恒河猴的病毒检测结果发现,猕猴疱疹病毒1型（BV）和猴痘病毒（SPV）抗体的阳性率分别为20．7％（6／29）和10．0％（2／20）,20只恒河猴中没有发现猴反转录D型病毒（SRV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）和猴T细胞趋向性病毒Ⅰ型（STLV—1）的抗体。5只受检的人工繁育的安徽恒河猴没有感染沙门菌、皮肤病原真菌、志贺菌和结核分枝杆菌的这四种病原菌。肉眼检测恒河猴体表,未发现体外寄生虫。39份人工繁殖的恒河猴粪便样品的总寄生虫感染率为38．5％,检测到溶组织内阿米巴和5种蠕虫（粪类圆线虫、猴结节线虫、绦虫、钩虫、蛔虫）,感染率最高的是粪类圆线虫和猴结节线虫。本次调查表明,安徽恒河猴无特殊疾病,健康状况基本良好,可以建立普通级的实验恒河猴,实现安徽恒河猴的实验动物化。     

2型单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5的真核表达及其对Ve-ro细胞活性的影响

目的:在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)毒力蛋白感染细胞多肽34.5(ICP34.5),并检测其对Vero细胞活性的影响。方法:PCR扩增HSV-2的ICP34.5基因,连接至pEGFP-C2载体,并对重组真核表达载体pEGFP-ICP34.5进行双酶切测序验证;将重组子瞬时转染Vero细胞,RT-PCR检测其在mRNA水平的表达,荧光倒置显微镜观察融合蛋白的表达,MTT法检测细胞活性。结果:经双酶切和测序验证表明pEGFP-ICP34.5构建成功,转染细胞后经RT-PCR验证有目的基因的转录,荧光显微镜下观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达,MTT法检测结果证实重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用。结论:构建了pEGFP-ICP34.5真核表达载体,其能在Vero细胞中高效表达,并能抵消空质粒对细胞的损伤作用。     

恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法的建立

目的建立一种简单、经济、高效的培养恒河猴外周血单核巨噬细胞(monocyte-derived macrophage,MDM)的方法。方法用肝素钠抗凝管采集成年恒河猴(Macaca mulatta)全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于Cell BIND Surface的96孔(0.8×106个细胞/孔)或48孔培养板(3×106个细胞/孔)中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的RPMI 1640培养液培养24 h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7 d后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体(CD14)抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素(LPS)刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒(SIVmac17E-Br、SIVmac251)和人-猴嵌合体艾滋病毒(SHIV KU-1)感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数(85%)猴单核细胞能在24 h内贴壁,体外分化5~7d后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度(4%,8%或10%)猴自体血清或FCS的RPMI 1640培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

猴T淋巴细胞趋向性病毒1型双抗原夹心ELISA检测试剂盒的研制

目的研制灵敏度和特异性高的检测实验猴血清中T淋巴细胞趋向性病毒-1型（STLV-1型）／E体的双抗原夹心ELISA（dsELISA）检测试剂盒。方法采用经原核表达系统表达并纯化的人T淋巴细胞白血病病毒-1型（HTLV-1型）的Env蛋白作为包被用抗原,建立了检测STLV-1的dsELISA诊断方法。通过优化反应条件和筛选试剂,确定了dsELISA诊断试剂盒的相关条件,并经敏感性、特异性和重复性试验考查该试剂盒质量。结果试剂盒特异性好,批内重复试验变异系数（CV）〈7％,批间重复试验CV〈10％。对200份猴血清进行随机检测,与国际公认的诊断试剂盒（美国BioReliance公司）的符合率为97％。结论本试剂盒可初步应用于临床上实验猴STLV-1型抗体的检测。     

猴 B 病毒血清学和 PCR 检测结果比较

目的：比较猴B病毒血清抗体和病毒PCR检测结果,阐明动物感染后病毒在机体内的存在状况。方法：采集成年猴血清和三叉神经组织,首先通过ELISA方法检测血清中B病毒抗体,然后采用B病毒舡和徊基因引物通过PCR方法扩增血清DNA和三叉神经组织DNA,比较2种方法的检测结果,并对扩增产物进行序列分析。结果：22份猴血清中,B病毒抗体呈阳性的有13份（59．1％）;PCR结果显示,抗体阴性动物及所有血清DNA模板中均无阳性扩增,但在13份抗体阳性动物的三叉神经组织DNA样品中,PCR阳性4份（30．8％）;gL和gD基因扩增条件及产物分析表明,舡基因的GC含量为64．1％,gD为74．2％,且舡的扩增条件和效果明显优于gD。结论：B病毒感染猴后,将在部分动物神经节中建立潜伏,而础基因更适合作为分子鉴定的靶标。     

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒。亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主。感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化。本研究初步建立了SV40 病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺。使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。随后对SV40 病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合。本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40 感染实验奠定了良好的基础。     

北京地区食蟹猴的室内试验性繁殖初报

目的食蟹猴在北京地区的适应性驯养与繁殖。方法从2004年底开始,建立了一个20只雄猴,140只雌猴的食蟹猴室内生产繁殖种群。每个室内饲养单元内包括两只雄猴,14只雌猴,采取自由交配的方式进行繁殖。同时对室内饲养食蟹猴繁殖的季节性、妊娠期、月经周期、仔猴出生体重等进行了观察、记录和统计。结果从2005年4月到2008年3月的3年时间,母猴怀孕305例,流产59例,生产仔猴246只。平均妊娠率、产仔率分别为74.0%和59.7%。室内饲养食蟹猴的繁殖没有明显的季节性,平均月经周期为（28.5±3.3）d（n=30）,平均妊娠期为（167±12）d（n=30）,仔猴的平均出生体重为（350±120）g（n=30）。结论食蟹猴能够在温带地区的室内进行成功的驯养和繁殖。     

六个肥胖相关基因在食蟹猴2型糖尿病不同发病时期的差异表达

2型糖尿病(T2DM)是一种与基因密切相关的高发性代谢性疾病。采用高脂饮食(其中含15%猪油)喂养25只中老年雄性食蟹猴的方法,制备T2DM模型,通过检测血糖与血脂水平确定疾病发展进程,并利用实时PCR对外周血白细胞中的6个肥胖相关基因mRNA表达量进行测定。食蟹猴T2DM在临床前期和临床期口服糖耐量实验(OGTT)2-h血糖值分别为(11.06±6.05)mmol/L和(13.12±2.89)mmol/L,显著高于正常组;空腹血糖在临床期达到最大值,为(7.58±1.56)mmol/L(P<0.01),说明其T2DM模型被成功诱导。但所检测的6个糖尿病肥胖相关基因中只有CDKN2B、IGF2BP2和FTOmRNA表达量与糖尿病发病进程呈正相关,且临床期IGF2BP2和FTO的表达量分别是对照组的65.92倍和4.30倍,差异极显著(P<0.01)。因此,基因CDKN2B、IGF2BP2和FTO可作为食蟹猴糖尿病早期诊断及预后评价的参考指标。     

表达神经营养因子Neurturin的骨髓间充质干细胞的构建及体外活性检测

研究神经营养因子Neurturin(NTN)在由于神经元损伤而造成的神经退行性疾病中对神经元的保护和修复作用。利用重组腺病毒载体将NTN基因转入恒河猴骨髓间充质干细胞(rMSC),通过RT-PCR、IF及Western blot方法检测NTN的转录和表达,并采用鸡胚背根神经节体外培养实验和胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元存活实验对NTN进行体外活性检测。结果表明NTN在rMSC中稳定表达和分泌,并具有体外生物学活性,为由于神经元损伤造成的神经退行性疾病的干细胞移植治疗奠定了一定的基础。     

人工繁殖恒河猴的血清前清蛋白、转铁蛋白、苹果酸脱氢酶和醇脱氢酶遗传多态性研究

用薄层聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析118头人繁殖恒河猴血清四种蛋白质和同工酶遗传基因位点的多态性,结果表明,除醇脱氢酶(ADH)为单态外,其余三个基因位点均表现多态,前清蛋白(PA)可分为AA、AB、AC、AD和BB、CC,EE七种表型,各基因的频率为A 0.85,B 0.072,C 0.042,D 0.009,E 0.034转铁蛋白(Tf)可分为CC、DD、EE、FFGG、CD、CE、CG、CH、DE、DF、DG、DH、EF、EG、EH、FG十七种表型,墓因频率为C 0.064,D 0.380,E 0.188,F 0.111,G 0.244,H 0.014,苹果酸脱氢酶(MDH)可分MDH)1-1和MDH2-1两种表型,基因频率为MDH~10.958和MDH~20.042。