极端酶的研究进展

极端酶具有超常的生物学稳定性,能够在极端温度、pH、压力和离子强度下表现出生物学活性,因此极端酶为生物催化和生物转化提供了良机.新的极端物种的发现、基因组序列的确定及基因工程技术的应用,加快了发现和制备新酶的进程.蛋白质工程和定向进化技术进一步改善酶的活性和特异性,促进了极端酶的工业应用.对极端酶的研究加深了人们对酶稳定性机制的理解,丰富了分子进化理论.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

枯草杆菌可溶性YlyA蛋白的诱导表达与纯化研究

YlyA是枯草杆菌一种功能未知蛋白.本研究旨在建立可溶性YlyA的诱导表达体系和纯化方法,为其功能研究奠定基础.PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSⅢ中构建表达载体pNG252,用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析,最后对可溶性YlyA重组蛋白进行Ni2+-WTA亲和层析加以纯化.结果表明pNG252中ylyA的插入方向正确,序列无突变;用0.5 mmol/L IPTG,37℃诱导3 h时,YlyA虽高效表达,但为包涵体形式;调整诱导条件至0.05 mmoL/L IPTG,25℃,5 h时,高效表达的YlyA部分转为可溶性蛋白.纯化后的YlyA浓度达204.2119 μmoL/L;调整洗涤液中的咪唑浓度至15 mmol/L,pH至9,可使纯化蛋白的产量大幅提高.本文成功构建了YlyA高效可诱导表达载体,建立了可溶性蛋白的诱导表达条件,确立了Ni2+-NTA亲和层析纯化方法,所得的6×His-YlyA融合蛋白,可用于YlyA晶体结构和与功能分析.     

RAPD技术在抗生素生物合成基因克隆表达中应用的研究

抗肿瘤抗生素c-1027具有极强抗肿瘤活性．其分子结构由一个酸性蛋白和脂溶性发色团构成,本文首次将RAPD技术(随机扩增的多态性DNA技术)运用于抗生素生物合成基因克隆表达研究。采用7种引物对5种C-1027无活性阻断变株总DNA进行扩增．其中引物GA2扩增C-1027原株及阻断变株后,琼脂糖凝腔电泳结果表明,F2DNA片段存在于原株而在变株AF67中缺失,采用载体质粒pU459将该DNA片段F2克隆至变铅青链霉菌．获得含重组质粒pIF2的菌株No155。No155菌株和无括性阻断变株AF67共培养后,发酵产物恢复了抗菌活性及抗瘤作用。SDS-PAGE及紫外光谱证实产物为C-1027。这表明F2DNA片段古有编码C-1027生物合成的基因。     

产乙醇酸氧化酶的重组毕赤酵母的构建及催化合成乙醛酸的研究

乙醇酸氧化酶（Go）是植物光呼吸途径中的一种关键酶,可以催化乙醇酸生产乙醛酸。从新鲜菠菜叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术获得编码GO基因的cDNA片断。通过基因重组将GO基因克隆到载体pA0815中,构建了胞内表达载体pA0815／GO,重组质粒经电转整合至甲醇营养酵母GS115染色体。在混合碳源为10g/L山梨醇和0．5g/L甲醇的培养条件下,细胞的GO酶活达到474IU／g（DCW）。利用该重组毕赤酵母作为催化剂生产乙醛酸,结果表明：在乙醇酸浓度为0．25mol／L,重组酵母湿菌体为10dL,黄素单核苷酸（FMN）浓度为0．01mmol／L,pH8．0,20℃,反应18h后乙醛酸的产率达到51．8％。     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含P_R启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）、重组人白细胞介素-3（hIL-3）和抗溶菌酶（HEL）抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36％以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对P_R启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以P_R、P_L或P_RP_L作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用P_R或P_L启动子可获得与使用P_RP_L串联启动子一样的高效表达.     

用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯

顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯（简称DHCD）是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E. coli JM109 (pKST11),采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶（Toluene dioxygenase,TDO）活性的方法,研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明：（1）发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达,不利于细胞生长,在对数生长中期（6或8h）,采用0.5mmol/L IPTG即可诱导出TDO的最高表达。（2）发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶(TDO)的活性有抑制作用,而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害,明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法,DHCD的产量仅有75 g/L;批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到226 g/L,是通气供苯法的3倍;而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到368 g/L,是通气供苯法的5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾,获得较好的转化结果。     

志贺菌福氏2a入侵上皮细胞诱导表达的毒力相关基因筛选与鉴定

采用体内表达技术的研究策略筛选了志贺菌福氏2a侵入上皮细胞后诱导表达的基因,用基因突变技术进一步对它们的功能进行了鉴定.结果共筛选到13个胞内诱导基因,其中2个DNA甲基化相关基因、1个代谢相关基因、1个转录调控基因、3个插入成分、3个反义转录体、3个未知功能基因.突变体分析发现,3-甲基糖基化酶,柠檬酸裂合酶的编码基因和未知功能基因wcaJ的突变体在细胞和动物感染实验中都显示其存活增殖能力的降低,表明这些基因可能参与了志贺菌在上皮细胞内的存活和增殖.同时也表明,这种在上皮细胞内的存活增殖能力是志贺菌主要的毒力体现之一.但是,未知功能基因yaiC的突变体只在动物体内表现出明显的毒力缺陷,在上皮细胞内没有明显的增殖缺陷,这表明yaiC基因参与其他毒力作用机制.研究结果对深入认识志贺菌的致病机理有重要意义.     

通过染色体外同源重组建立乳腺中表达外源基因的转基因小鼠

为研究染色体外重组方法在创建转基因动物中的应用,选取牛asl酪蛋白基因的5′及3′侧翼区和氯霉素乙酰化酶编码区,构建了两个具有3 kb相互重叠的融合基因.将这两个DNA片段末端脱磷酸后,以摩尔比1:1的比例混合,通过显微注射导入小鼠受精原核,最后获得了11个品系的转基因小鼠.对其中10个品系的小鼠的整合分析表明,所注射的两个DNA片段均发生了染色体外同源重组,而且除了 1个品系的小鼠丢失了大约1kb的序列外,其余品系小鼠的重组产物与预想的结构符合.在当代和后代的转基因小鼠乳汁中均可测到氯霉素乙酰化酶的活性.这表明融合基因在转基因小鼠乳腺中得到表达和分泌,也说明显微共注射两个相互重叠的基因片段是建立转基因动物的一个可行途径.