肠道病毒溶瘤作用的研究进展

溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)是一类能选择性地在肿瘤细胞中复制并且能够溶解肿瘤细胞,对正常组织细胞无损伤的自然状态或基因改造过的病毒。肠道病毒(enterovirus)是一类单股正链RNA病毒,包括脊髓灰质炎病毒(Poliovirus, PV)、柯萨奇病毒和埃可病毒等。研究证实多种肠道病毒具有溶瘤作用,如已在拉脱维亚等国上市的RIGVIR~?(埃可病毒7型,Echovirus 7, ECHO7),已进入Ⅱ期临床试验的柯萨奇病毒A组21型(Coxsackievirus A21, CVA21),以及处于临床前研究阶段的柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3, CVB3)及PV等。现就有关肠道病毒的溶瘤作用作一概述。     

柯萨奇病毒A5病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定

目的构建柯萨奇病毒A5(coxsackievirus A5, CV-A5)病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并对其进行纯化和鉴定。方法①将CV-A5 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞密码子偏好性,对CV-A5-3487R4/CHN XY/2017株基因进行优化并合成,然后分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(polyhedrin promotor, pPh)和pPl0启动子后,构建pFastBacDual-Pl/3CD重组质粒;②重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli,)DH10 Bac~(TM)中,转座形成重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid, bacmid);③再将重组bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒并表达CV-A5结构蛋白、组装VLPs。应用限制性酶切、PCR扩增、免疫荧光(immuno-fluorescence assay, IFA)技术对CV-A5 VLPs的蛋白进行鉴定;④再利用蔗糖垫底离心和氯化铯(CsCl)密度梯度离心的方法纯化CV-A5 VLPs,并用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜法进一步检测CV-A5 VLPs的浓度和纯度及颗粒形态。结果 pFastBacDual-P1/3CD重组质粒经限制性双酶切、重组Bacmid PCR鉴定、rCV-A5 VLs PCR鉴定结果显示,均在预期目标处有清晰条带。利用IFA检测重组病毒rBacCV-A5-P1/3CD蛋白,结果可见明显荧光。rCV-A5 VLPs经SDS-PAGE检测到VP0为39 000、VP1为34 000和VP3为27 000;Western Blot检测也可见相应特异性条带。利用透射电镜观察纯化rCV-A5 VLPs,可见直径为23～33 nm的颗粒,形态和大小均与CV-A5一致。结论成功构建了rBacCVA5-P1/3CD重组病毒,并在sf9细胞内成功表达了CV-A5 VLPs,为今后CV-A5 VLPs疫苗的研发奠定了基础。     

Etk敲除及过表达细胞株构建并探讨Etk对细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR-Cas9技术在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中构建Etk(Epithelial and endothelial tyrosine kinase)敲除稳定细胞株以及利用慢病毒构建Etk过表达稳定细胞株,并初步探讨Etk基因对HUVECs细胞增殖的影响。方法:利用CRISPR-Cas9技术,使用在线工具设计针对Etk的sgRNA (https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)。将sgRNA利用连接酶整合到病毒载体中,包被病毒并感染HUVECs敲除HUVECs中的内源性Etk。利用嘌呤霉素筛选得到Etk敲除的稳定细胞株。PCR扩增Etk基因序列,将其整合到pLEX-MCS慢病毒过表达载体中构建Etk过表达重组质粒。包被病毒并感染HUVECs,在HUVECs中过表达Etk,利用嘌呤霉素筛选得到Etk过表达的稳定细胞株。利用qRT-PCR和Western-Blotting检测Etk的敲除和过表达情况。利用CCK-8盒子检测两种稳定细胞株细胞增殖情况。结果:利用CRISPR-Cas9技术有效的敲除HUVECs中内源性Etk,同对照相比,Etk的mRNA和蛋白水平显著地降低(P0.01)。同时利用慢病毒在HUVECs中过表达Etk,同对照相比,在过表达Etk稳定细胞株中Etk的mRNA和蛋白表达显著上调(P0.01)。CCK-8检测发现,Etk敲除降低细胞增殖能力;而Etk过表达增加细胞增殖能力。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功在HUVECs中敲除Etk,利用慢病毒过表达系统成功的在HUVECs中过表达Etk,并且初步验证了Etk促进HUVECs细胞增殖。     

HIV-1 Env三聚体抗原改造研究进展

HIV-1疫苗研发是当前艾滋病研究的一大热点,其病毒表面包膜糖蛋白Env三聚体介导病毒与细胞融合,是HIV-1疫苗研究的重要靶点。因此,设计并在体外表达类天然Env三聚体对HIV-1疫苗的研发具有重要的意义。近年来,Env三聚体研究取得了显著的进展。SOSIP、NFL2P、UFO等抗原改造方法实现了类天然Env三聚体的体外表达,逐步解决了改造抗原产量低、结构不稳定等问题,且表达的Env三聚体抗原能在动物免疫中诱导机体产生较高的中和抗体水平。Env三聚体改造方法促进了HIV-1疫苗的研究。文中综述了SOSIP、NFL2P、UFO三种HIV-1 Env三聚体抗原改造方法,对比各个改造方法优缺点,并结合自身工作提出相关建议,为后续HIV-1抗原的相关设计提供指导。     

曲美他嗪或生脉饮联合黄芪注射液治疗急性病毒性心肌炎的临床对比分析

目的:探讨曲美他嗪或生脉饮分别与黄芪注射液联用治疗急性病毒性心肌炎(AVMC)的临床疗效。方法:选取2013年4月~2016年4月我院收治的AVMC患者140例,按随机数字表法分为对照组(n=45)、曲黄组(n=46)及生黄组(n=49)。对照组患者给予常规药物治疗,曲黄组在对照组的基础上给予曲美他嗪联合黄芪注射液治疗,生黄组在对照组的基础上给予生脉饮联合黄芪注射液治疗。比较三组患者中血清肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌钙蛋白I(cTnI)水平、心电图指标、临床总有效率、临床症状改善及不良反应情况。结果:治疗后,曲黄组和生黄组总有效率均显高于对照组,曲黄组总有效率高于生黄组(P0.05)。曲黄组和生黄组患者的心悸和胸痛发生率低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。曲黄组和生黄组患者血清CK-MB、cTnI水平低于对照组,且曲黄组低于生黄组(P0.05)。曲黄组患者房室传导阻滞、ST-T变化、室性期前收缩发生率低于对照组(P0.05)。三组患者不良反应发生率比较无统计学差异(P0.05)。结论:曲美他嗪联合黄芪注射液治疗AVCM的总有效率高于生脉饮联合黄芪注射液治疗,降低心肌损伤程度,改善临床症状,无严重不良反应,值得临床推广应用。     

凝结芽孢杆菌活菌片联合米氮平治疗腹泻型肠易激综合征的疗效观察

目的观察及评估凝结芽孢杆菌活菌片联合米氮平治疗腹泻型肠易激综合征(diarrhea irritable bowel syndrome,IBS-D)的临床疗效。方法将67例腹泻型肠易激综合征患者随机分成3组,A组服用凝结芽孢杆菌活菌片联合米氮平片治疗;B组单用米氮平片治疗;C组单用凝结芽孢杆菌活菌片治疗。连续用药4周,观察疗效和安全性。结果 A组患者总有效率为95.5%,明显高于B组的63.6%和C组的65.2%(P0.01),B组共有3例患者治疗后出现轻微头晕、嗜睡、乏力症状,A组和C组患者未见任何不良反应。结论凝结芽孢杆菌活菌片联合米氮平治疗腹泻型肠易激综合征能显著改善患者临床症状及生活质量,效果显著,安全可靠,值得进一步临床推广使用。     

中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定

2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒(YN12039、YN12040、YN12060),该病毒只引起C6/36细胞发生病变。负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60~80nm,有囊膜,表面有刺突。采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、HEL1(superfamily 1helicase)、S蛋白(spike protein)基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒(NDiV)RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度最高,均为98%以上。系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系最近,处于同一进化分支。该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考。     

在我国患急性腹泻成人中发现一种新轮状病毒

从3例急性成人腹泻患者粪便中,经电镜观察,成人腹泻轮状病毒—酶联免疫吸附试验(ADRV-ELISA)、普通轮状病毒—酶联免疫吸附试验(Rota-ELISA),猪抗C型(组)轮状病毒和鸡抗D型(组)轮状病毒血清分别与本病毒的免疫电镜试验以及RNA电泳等实验结果,发现了一种新轮状病毒,该病毒的形态结构与普通轮状病毒(Rotavirus)、成人腹泻论状病毒(Adult Diarrhoea Rotavirus,简称ADRV)极为相似,但抗原性与普通轮状病毒(A组),成人腹泻轮状病毒(B组),C型轮状病毒(C组),D型轮状病毒(D组)显然无关。基因分析表明,该病毒基因组由11个双链RNA片段组成,但其RNA电泳图型具有独自的特点,与目前公认的A组、B组、C组、D组论状病毒韵RNA电泳图型均不同,免疫电镜证实,该病毒能被人恢复期血清所凝集,表明该病毒可能是腹泻病人的病因。     

大熊猫犬瘟热病毒融合蛋白基因3‘端的序列测定

从死亡大熊猫的肝脏中直接提取细胞总ＲＮＡ,经反转录后,用犬瘟热病毒的两对引物,分两段扩增出融合蛋白基因３＇端的片段。经序列分析表明：此片段的长度为６９３ｂｐ;此毒株在核苷酸和氨基酸水平与某疫苗弱毒株、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株、海豹瘟热病毒２型毒株和海豹瘟热病毒１型的同源性分别为９７．５％和９６．２％、８８．６％和９４．５％、９２．９％和９５．６％、６３．２％和７６．５％;大熊猫毒株与其它毒     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。