大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

鉴定猪,牛及绵羊肥大细胞的组织化学技术

研究证实Ｃａｒｎｏｙ液和中性缓冲福尔马林溶液（ＮＢＦ）是猪、牛及绵羊肥大细胞的优良的固定液,ＮＢＦ虽能很好地保存牛和绵羊的肥大细胞,但却阻断了猪的大多数肥大细胞、特别中肠粘膜肥大细胞（ＭＭＣ）及胸腺髓质肥大细胞（ＴＭＭＣ）对碱性染料的着染力。力苯胺蓝及阿尔辛蓝均为动物肥大细胞的优良染料,但阿尔辛蓝能使更多的肥大细胞着力。甲苯胺蓝及阿尔辛蓝均为动物肥大细胞的优良染料,但阿尔辛蓝能使理多的肥大细胞着染     

大额牛产犊行为观察

采用直接观察法对大额牛(Bos frontalis)的产前离群与产后带犊归群、分娩等产犊行为进行了观察。结果表明,(1)野外观察17头临产母牛中,76.47%(13头)的个体在产前(11.23±7.14)d离开社群独行觅食,寻找分娩场所;分娩地点多选择在靠近溪河、地势较高、食物丰富、光照好、地面相对平坦的草地、林边或林中。母牛野外产犊后带犊归群的时间为产后(5.57±2.64)d。(2)在设围栏的人工草地上放牧条件下对6头母牛分娩行为观察表明,产前24～12 h母牛的警觉巡视行为明显增多;产前12～5h表现为烦燥不安和频繁爬跨;产前3～1 h领地行为明显,对分娩地点4～6 m2内长势较高的牧草等进行清理,为新生犊牛行动清除障碍;分娩时间为6:00～18:00时,其中在6:00～7:00时分娩的占66.67%(4/6);母牛从卧地进入分娩至犊牛产出期间起卧(7.00±6.00)次,从卧地到犊牛完全产出需(25.00±5.00)min,胎衣排出的时间为产后(5.64±1.80)h;犊牛(n=6,♂1+♀5)初生体重为(16.46±2.56)kg,母牛无难产现象;母牛对犊牛能及时舔饰,定时授乳和用心守护。犊牛从产出至第一次站稳需(52.70±29.69)min,第一次站稳到吮吸初乳需(38.7±29.14)min,第一次吃初乳到向周边活动需(61.33±1.53)min。     

利用基因芯片技术筛选秦川牛公牛与阉牛肌肉组织差异表达基因

为了筛选秦川牛公牛和阉牛肌肉组织差异表达的基因,探讨二者肉质差异的分子生物学机理,文章利用Affymetrix公司生产的牛基因组芯片技术,分别检测了3头36月龄秦川牛公牛与阉牛背最长肌肌肉组织的mRNA表达水平变化;运用Significance Analysis of Microarrays(SAM)法对秦川牛公牛和阉牛基因表达谱进行了差异分析;并通过分子注释系统平台(MAS2.0)对差异表达基因进行了功能富集类分析和调控通路分析;最后应用实时定量PCR技术对部分差异表达基因进行了验证。基因表达谱分析结果显示,在36月龄秦川牛的肌肉组织中,共检测到约11000个探针,代表大约10000个基因。共筛选出差异表达基因143条,主要涉及胶原纤维的组织和合成、细胞粘附、细胞生长调控、泛素介导的蛋白分解代谢和横纹肌收缩等生物学过程;在分子注释系统数据库中注释到的显著调控通路为细胞外基质受体反应、细胞通讯、焦点粘连和紧密连接等;所验证的差异表达基因的荧光定量PCR结果与芯片结果基本一致。结合已有的文献报道,文章初步认为ECM受体反应、细胞通讯、焦点粘连、紧密接头等调控通路及COL3A1、COL1A1、COL1A2、SPP1、FBN1、MMP2、ECM1、MYH3、MYH8、S100A4、ASPN、CFD等基因可能是参与调控秦川牛阉割前后肉质性状差异的重要调控通路和基因。此外,还筛选出一些尚未在GenBank上登陆的序列,推测可能是未知的新基因,它们在牛肉质代谢过程中的作用还需进一步的研究证明。     

牛奶子花粉形态特征与生活力测定

采用两种扫描电镜样品制备技术制备牛奶子花粉,扫描电镜观察其形态,研究结果表明:经自然干燥法制样,牛奶子花粉外观变形严重;采用固定—脱水制样,花粉外形保持良好,牛奶子花粉近球形,极面观钝三角圆形,具3沟,表面具脑纹状雕纹。采用I2-KI染色法测定牛奶子花粉开花后不同时间的生活力,结果表明:牛奶子花粉生活力在开花初较高,并在开花后36h内维持在80%以上,之后迅速下降,但在花期末仍有部分花粉具有生活力。     

去细胞牛颈静脉构建组织工程右心带瓣管道体内实验初步研究

目的:将体外构建的组织工程右心带瓣管道,以带瓣补片的形式移植于犬主肺动脉,观测带瓣管道材料体内情况.方法:去细胞处理牛颈静脉体,无菌处理后种植标记过的犬骨髓间质干细胞,构建组织工程带瓣管道,犬开胸手术,将体外构建的组织工程右心带瓣管道,以带瓣补片的形式移植于犬主肺动脉,术后4、8、12行胸部B超检查;取出补片,HE染色;荧光显微镜下标记细胞检测;样本钙含量测定.结果:术后犬胸部B超观察:瓣叶无增厚,钙化,管道血流通畅,无血栓及钙化.术后4、8、12周除了瓣叶逐渐缩小外,补片无动脉瘤形成,瓣膜表面光滑,无血栓形成,弹性良好,血管壁内面光滑,无血栓形成.种植种子细胞牛颈静脉带瓣补片成活.4周钙含量增加,8周时候,钙含量又有增加,12周时钙含量与8周相比无明显变化.结论:组织工程技术构建组织工程右心带瓣管道有可行之处.     

体细胞克隆牛产品安全分析

体细胞克隆技术是将已分化的体细胞移到去核的成熟卵母细胞中,通过体外激活和培养,再移植入受体母畜子宫内,繁殖出具有相同基因型后代的一种技术。该技术可以大幅提升繁殖效率,并提供高质、充足和营养丰富的动物食品。近年来,美国、日本和欧洲等国家相继宣布体细胞克隆动物食品可以上市。然而,目前体细胞克隆效率相当低下,即使是出生的克隆动物也往往伴随发育畸形或高死亡率等现象,在对克隆动物发育异常知之甚少的情况下,宣布克隆动物产品上市是否为时过早?以下综述了克隆牛肉、奶及其产品安全。     

Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析

体细胞核移植(体细胞克隆)技术在动物生产、医药工业、治疗性克隆以及对珍稀濒危动物的拯救有重要意义,然而克隆效率低下以及克隆动物发育异常,严重制约了克隆技术的发展和应用．在体细胞核克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,发生在核移植后几小时内供体核的重编程,决定了克隆胚胎的发育能力．印记基因是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性,而DNA甲基化是调控印记的一个主要方式．印记基因Mash2在胚胎发育和器官形成过程中起着非常重要的作用．为了探求核移植过程中Mash2基因DNA 甲基化的表观重编程是否充分,利用亚硫酸氢盐测序法对出生48 h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中Mash2基因的DNA甲基化状态进行分析．结果显示,尽管位于Mash2基因启动子和第一个外显子处的CpG岛在正常牛和克隆牛中甲基化水平都不高(20.04%,5.55%),但克隆组的甲基化水平仍显著低于正常对照组 (P < 0.05)．甲基化模式正常组中9N3有5种不同的形式,9N4仅1种;而克隆组9C3和9C5也分别是1种．推测Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因．     

中国紫金牛属圆齿组果实微形态特征研究

对国产紫金牛科紫金牛属圆齿组(Ardisia Sect. Crispardisia)16种植物的果实表面进行了扫描电镜观察。经观察果实为球形,表面多无毛,稀有柔毛。多数种具腺点,极少数无腺点或不明显,腺点疣状、粒状或横棒状,腺点常与果实表面突起具对应关系。果实表面纹饰大致可分为3种:基本平滑、多皱、波状网纹。某些种不同部位的纹饰差异较为明显。本研究结果对种间鉴别具有重要意义,并且不支持将珍珠伞A. maculosa归并入钮子果A. polysticta中。     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。