植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

不同结香方法对土沉香木质部芳香物质形成的影响*

探究不同结香方法对土沉香木质部芳香物质形成的影响,为创新和优化土沉香结香技术提供理论参考。设置钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌溶液3个结香处理,12个月后取样检测各处理的土沉香木质部组织变色范围、淀粉和可溶性糖含量,并用95%乙醇(色谱纯)提取个处理土沉香样品的醇溶提取物,测定沉香四醇和主要芳香物质成分。结果表明：(1) 黄绿墨耳菌溶液处理的土沉香木质部组织变色范围最大,纵向变色距离最长达120cm,横向变色距离最宽达3.84cm;钻孔和火烧孔处理,纵向变色距离均超过120cm,但横向变色距离最宽仅为0.58cm和1.06cm。(2) 3种结香处理的土沉香木质部组织淀粉含量均显著低于CK (P＜0.05),降幅范围在24.82~55.25%;黄绿墨耳菌溶液和火烧孔处理的土沉香木质部组织可溶性糖含量均显著高于CK (P＜0.05),钻孔与CK差异不显著((P＞0.05)。(3)钻孔、火烧孔和菌液处理沉香醇溶性提取物含量达到11.84%、13.26%和21.08%,显著高于CK (P＜0.05);沉香四醇含量达到0.18%、0.26%和0.42%,对照处理未检测出沉香四醇。(4) 钻孔、火烧孔和黄绿墨耳菌溶液处理的土沉香芳香物质中分别鉴定出29种、33种和36种,主要成分包括色酮及其衍生物、沉香螺醇、愈创木醇、香树烯、苄基丙酮、二氢卡拉酮、枯苏醇、α-檀香醇和壬醛。说明黄绿墨耳菌溶液诱导土沉香木质部组织变色范围最大,淀粉含量消耗和可溶性糖增幅最大,醇溶提取物、沉香四醇含量及其芳香物质积累的效果最优。     

ε-聚赖氨酸抑菌性能的研究进展

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是抑菌谱广泛的天然抑菌剂,由通过α-羧基与ε-氨基连接的25–35个赖氨酸聚合而成。ε-PL主要由白色链霉菌发酵生产所得,比化学生产更加高效和环保。ε-PL具有水溶性好、耐热和对环境无污染等特点,具有良好的应用前景。本文从发酵生产入手,着重综述了ε-PL对各种微生物抑菌性能、抑菌机制及抑菌机制模型的研究进展。推测ε-PL是通过对细胞膜的破坏而改变细胞的通透性,或者作用到细胞内引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)胁迫而影响调节基因的表达,从而起到抑菌作用。根据这2种抑菌方式分别建立了相应的抑菌模型,即毡毯模型和ROS诱导细胞凋亡模型。本文可为ε-PL对微生物抑制性能的深入研究提供依据,同时也提出了ε-PL抑菌机制的新模型,为扩展ε-PL应用领域提供了一定的参考。     

微生物镉解毒机制及微生物-植物互作修复研究进展

镉(cadmium,Cd)是引起粮食减产的主要金属之一,具有高溶解性及高迁移性,易被植物吸收和积累。微生物长期在镉胁迫的条件下进化出一系列的镉解毒机制。微生物对镉的解毒包括抑制Cd(Ⅱ)的进入、促进Cd(Ⅱ)的外排,以及将进入胞内的Cd(Ⅱ)进行“扣押”。微生物的Cd(Ⅱ)钝化是通过细胞吸附和胞外沉淀将游离态的Cd(Ⅱ)进行钝化,这类微生物具有较强的土壤镉污染治理潜力。本文主要介绍微生物的镉解毒机制、微生物-微生物互作、微生物-植物互作机制及其在镉污染生物修复中应用的最新研究进展。     

基于植物-土壤反馈的不同绿肥驯化微生物对玉米生长的影响

【背景】在农田生态系统中,土壤微生物与植物互作的机制仍不清楚。【目的】进一步加强对植物-微生物互作的认识,筛选出引起不同反馈作用的关键微生物或微生物类群。【方法】采集豆科绿肥救荒野豌豆(Vicia sativa, V)、十字花科绿肥油菜(Brassica napus, N)和荒坡土壤(remnant prairie, R)驯化的田块土壤0-20 cm作为菌剂在温室进行植物-土壤反馈(plant-soil feedback,PSF)试验。土壤菌剂的接种量为10%,即有90%理化性质一致的灭菌土壤作为背景土,同时设置灭菌土壤菌剂作为对照(CK),种植玉米。每组土壤菌剂处理均分为50 mg/kg高磷(high phosphorus,HP)和5 mg/kg低磷(low phosphorus, LP)两个磷浓度处理。玉米收获后,测定产量和植株地上部磷含量,并取土壤样品进行高通量测序,解析不同养分供给情况下微生物对作物生长的反馈效应。【结果】高磷和土壤反馈效应均促进了玉米的生长。在低磷水平下,V、N和R处理的玉米地上部生物量均高于CK处理,但N处理的玉米地上部生物量增加最多(38%),且增幅显著高...     

肠道菌群在脊髓损伤后胃肠道炎症反应中的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)目前尚无有效的治疗手段。脊髓损伤后,患者常伴有严重的胃肠功能障碍,严重影响患者的生活质量。研究发现,脊髓损伤后肠道菌群的紊乱和脊髓损伤后的胃肠道功能障碍密切相关。因此,本文围绕脊髓损伤后肠道菌群的变化,探讨肠道菌群在迷走神经、下丘脑-垂体-肾上腺和肠道菌群代谢物3个途径中发挥的作用,及与胃肠道炎症反应相关的研究进展。     

1,4,5-三磷酸肌醇受体3促进常染色体显性遗传性多囊肾病囊泡生长

本文旨在阐明1,4,5-三磷酸肌醇受体3(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor 3, IP₃R3)在常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)肾囊泡发生、发展过程中的作用,为ADPKD的治疗提供理论基础。使用2-氨基乙氧基二苯基硼酸盐(2-aminoethoxy-diphenyl borate, 2-APB)和shRNA抑制IP₃R3的表达水平,通过MDCK(MadinDarby canine kidney)囊泡模型、胚胎肾囊泡模型、肾脏特异性Pkd1敲除(PKD)小鼠模型探究IP₃R3在囊泡生长过程中的作用,并通过Western blot、免疫荧光染色技术探究IP₃R3调控囊泡生长的分子机制。结果显示,在PKD小鼠肾脏中,IP₃R3的表达水平显著升高。在胚胎肾囊泡模型和MDCK囊泡模型中,通过2-APB或shRNA抑制IP₃R3...     

化学合成的DNA定位断裂工具

化学合成的 DNA 定位断裂工具是80年代初发展起来的一种新型非酶 DNA 定位断裂工具.它由 DNA 识别结合系统及化学断裂系统组成,能在人们预先设计的任何位点断裂 DNA 分子,具有制备简便、价格便宜、不受酶的天然专一性限制等优点.可应用于基因分离、染色体图谱分析、大片段基因的序列分析以及 DNA 定位诱变、肿瘤基因治疗与新的化学疗法等分子生物学领域.     

β-桧木醇联合替加环素对tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用

质粒介导tet(X4)基因的出现和流行,严重影响替加环素(tigecycline)对临床多重耐药细菌感染的治疗效果,急需寻找有效的佐剂遏制替加环素耐药性。本研究采用微量棋盘稀释法、时间-杀菌曲线测定β-桧木醇(β-thujaplicin)和替加环素的体外联合抗菌表征,通过测定细菌细胞膜通透性、细菌胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、铁含量以及替加环素含量等指标,来探究β-桧木醇和替加环素联合使用对tet(X4)基因阳性大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌作用机制。结果表明,β-桧木醇联合替加环素对tet(X4)基因阳性大肠杆菌具有体外协同抗菌效果,且β-桧木醇在抗菌作用浓度范围内无显著溶血性和细胞毒性。机制研究发现,β-桧木醇能显著增大细菌细胞膜的通透性,降低细菌胞内铁含量,干扰铁稳态,诱导细胞内ROS显著增加,从而发挥抗菌效果。进一步研究发现,β-桧木醇可通过干扰细菌铁代谢和增大细菌细胞膜通透性,协同增强替加环素的抗菌效果。本研究结果为β-桧木醇联合替加环素治疗tet(X4)基因阳性大肠杆菌感染提供了理论和实践基础。