风干土壤中氨氧化微生物的恢复

【目的】比较历史风干土壤与加水恢复培养土壤中氨氧化古菌AOA和细菌AOB的组成与数量差异,探究风干土壤用于后续微生物生理生态学研究的可能性;明确我国典型酸性森林土壤中,海洋类Group 1.1a是否为数量上占据优势的古菌AOA生态型。【方法】针对中国生态系统研究网络10个台站的典型森林土壤样品,围绕风干保存和加水培养两种处理,通过高通量测序土壤氨氧化古菌及细菌amoA标靶基因,分析氨氧化微生物群落组成的变化规律;利用实时荧光定量PCR和DGGE指纹图谱技术,研究森林土壤微生物群落16S rRNA基因的数量变化规律,以及氨氧化细菌和古菌群落结构的差异。【结果】10个历史风干土壤加水培养28天后,土壤细菌和古菌数量均急剧增加,最高可达3230倍和568倍;其中8个土壤中氨氧化古菌AOA明显增加,5个土壤中氨氧化细菌AOB表现出明显的增加趋势。然而,高通量测序和系统发育分析表明,历史风干土壤与加水恢复培养土壤中AOA和AOB的群落组成无明显变化。Group 1.1b是氨氧化古菌的优势类群,而氨氧化细菌的主要类群是Nitrosospira螺菌属。氨氧化古菌和细菌的比例与总氮浓度呈显著正相关(r2=0.54,P0.05),表明酸性条件下土壤矿化并提供铵态氮底物可能是古菌氨氧化的驱动机制。【结论】风干土壤加水恢复培养后,AOA和AOB的种群数量大多出现增加的趋势,但其物种组成未发生显著变化,表明风干保存的土壤样品可用于后续室内培养,开展微生物生理生态学研究。与已有的海洋AOA生态型主导酸性土壤氨氧化类群的报道不同,土壤Group 1.1b是本研究森林土壤中的优势类群。     

NaCl胁迫对高粱根、叶鞘和叶片液泡膜ATP酶和焦磷酸酶活性的影响

NaCl胁迫初期 ,Na 主要在根和叶鞘中积累。相应地 ,根和叶鞘液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、依赖ATP和PPi的质子泵活性及Na /H 逆向转运活性均明显增加 ,根和叶鞘的生长没有受到抑制。NaCl胁迫后期 ,Na 开始向地上部分运输并在叶片中积累。此时 ,叶片液泡膜质子泵和Na /H 逆向转运活性开始增加 ,根和叶鞘的Na/K比增加 ,其液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、质子泵活性和Na /H 逆向转运活性下降。相应地 ,根和叶鞘的生长也下降。当保温介质中Na/K比超过 1时 ,液泡膜微囊ATP酶和焦磷酸酶活性均随Na/K比的增加而下降。表明非盐生植物液泡膜质子泵在盐胁迫的初期对Na 在液泡内的积累及其耐盐性起重要作用     

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析

目的:研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)在铁皮石斛不同组织中的表达情况,探讨其与石斛多糖累积的关系。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的DoUGPase1序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛不同年份,不同组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个3054 bp基因,命名为DoUGPase1,其ORF长1530 bp,编码510个氨基酸残基,与油棕(Elaeis guineensis)和波斯枣(Phoenix dactylifera)有一定的同源性,且DoUGPase1在3年生的植株中相对表达量整体较高(P0.05)。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoUGPase1基因与多糖累积的活跃程度成正比例。     

灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法,获得盐生植物灰绿藜的液泡膜焦磷酸酶基因(VP1)全长cDNA,命名为CgVP1。生物信息学预测分析表明,CgVP1基因包含一个2 292bp的开放阅读框,编码763个氨基酸。CgVP1不仅具有与植物液泡膜焦磷酸酶共有的氨基酸序列DVGADLVGKVE,而且CgVP1与其它植物的VP1相似性达86%。跨膜结构域预测显示,CgVP1氨基酸序列含有12个跨膜螺旋区,可能定位于细胞膜系统上。RT-PCR检测表明,200mmol/L NaCl条件下萌发生长的灰绿藜,再进行800mmol/L NaCl胁迫处理24h后,CgVP1基因表达显著增强。不同浓度KCl、CaCl2、MgCl2分别处理24h,KCl和MgCl2浓度增高,CgVP1基因表达下降,CaCl2则不影响CgVP1基因表达。研究结果表明,灰绿藜CgVP1基因表达对不同种类盐胁迫响应不同,NaCl胁迫可以上调CgVP1基因表达。该研究结果有助于阐明盐胁迫对盐生植物灰绿藜CgVP1基因表达的调控作用。     

百合鳞茎发育过程中淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析

该研究通过同源克隆技术克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、颗粒结合淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(SSS) 3类百合淀粉合成关键酶基因,分析这三类淀粉合成关键酶基因的表达变化,测定百合鳞茎膨大发育中淀粉含量变化。结果表明:(1) AGPase具有GlgC家族蛋白PLN02241蛋白结构特征及cl11394家族蛋白ADP_Glucose_PP与NTP_transferase结构域,获登录号KP751443; GBSS与SSS具有cl10013家族蛋白Glyco_transf_5,GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like结构域,获登录号分别为KP751444、KP751445。(2)百合鳞茎形成与膨大发育过程中,淀粉含量呈现递增趋势,鳞茎盘开始分化茎杆时其淀粉含量最高,达到44.52%。鳞茎与叶片部位的三个淀粉合成相关酶基因表达量均逐渐增加;在鳞茎膨大后茎杆分化阶段,三个淀粉合成相关酶基因表达量达到最高,AGPase、GBSS、SSS在鳞片中的表达量分别为10.79,6.92和5.12,叶片中的表达量分别为6.79,5.22和4.41,鳞片中的表达量大幅度高于叶片;淀粉合成相关酶基因的表达量变化与淀粉含量、鳞茎的膨大发育成正相关。这为鳞茎的繁殖生产提供了可通过调节淀粉合成关键酶基因表达促进百合鳞茎膨大发育的思路。     

铝胁迫对小麦根系液泡膜ATP酶,焦磷酸酶活性和膜脂组成的效应

研究了铝胁迫下耐铝性不同的两个小麦品种根细胞液泡膜ＡＴＰ酶、焦磷酸酶活性和膜脂的变化。与对照相比,经２０和１００ｍｏｌ／Ｌ的ＡｌＣｌ３处理后,耐铝品种Ａｌｔａｓ６６的液泡膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ和和Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶活性迅速下降;铝敏感品种Ｓｃｏｕｔ６６液泡膜Ｈ＾＋－ＡＴＰ酶和Ｃａ＾２＋－ＡＴＰ酶活性则在２０μｍｏｌ／Ｌ时增加,１００μｍｏｌ／Ｌ时下降。焦磷酸酶活性在Ａｌ－ｔａｓ６６中下降,在Ｓｃｏｕｔ     

Genome Sequencer FLX引领快速基因组测序时代的到来

焦磷酸法最早是应用在检测DNA甲基化和SNP位点分析的一项技术,在2005年底,此技术被用来进行基因组序列的测定,已经成为下一代高通量测序中最成熟的一种技术.本篇文章着重介绍了采用焦磷酸测序法的罗氏公司最新一代高通量基因组测序系统GS FLX的技术原理,操作过程和广泛的应用范围.     

植物法呢基焦磷酸合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的番茄(Lycopersicon esculentum)、橡胶(Hevea brasiliensis)、香蕉(Musa acuminata)、苹果(Malus×domestica)、向日葵(Helianthus annuus)、葡萄(Vitis vinifera)等的法呢基焦磷酸合成酶的核苷酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、转运肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明:该酶基因的全长包括5’、3’非翻译区和一个开放阅读框;其编码的蛋白是一个无跨膜结构域、不具转运肽的亲水性蛋白,包括5个保守的结构motif,其中两个是富含天冬氨酸(Asp)的motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上是由α-螺旋围绕形成的中间具一个“大空穴”的立体结构,“大空穴”的表面藏有五个功能保守motif,其中两个Asp-motif位于“空穴”的内壁。     

水稻ADP—葡萄糖焦磷酸化酶的cDNA基因克隆和结构分析

用ＰＣＲ技术从我国水稻品种“中花１０ 号”（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ １０）的未成熟种子中克隆到ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因,进行了全序列分析,并与国外已报道的同类基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较。结果表明,作者克隆的ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因全长１４６１ ｂｐ,编码１个由４８３ 个氨基酸组成的多肽,与国外基因的核苷酸和推导氨基酸同源率分别为９９．６％ 和９９．７％ 。此外,还对该基因进行了结构及进化分析。     

焦磷酸测序测定SNP的常见问题与解决方法

目的:探讨焦磷酸测序技术对单核苷酸多态性分型因测序图谱中存在的一些典型问题而导致分型结果不准确的解决方法。方法:以VKORC1基因1639 GA位点、CYP2C19基因636 GA位点及UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7的多态性检测为例,分别采用优化PCR条件、改变测序时dNTP的加入顺序以及设立外标校正的方法来解决上述问题,从而提高焦测序对SNP分型的准确性。结果:通过升高PCR退火温度,可以显著提高VKORC1基因的扩增特异性,降低了测序图谱中非特异性信号峰强度;通过优化测序时dNTP的加入顺序,CYP2C19基因636 GA位点的准确分型结果可通过观察测序图谱中相关信号峰的有无而简单获得,避免了比较信号峰的相对强度;通过比较待测样本与已知基因型的外标样本的测序图谱来确定待测样本的基因型,提高了对UGT1A1基因TA重复序列(TA)6(TA)7多态性的分型准确性。结论:本文针对焦测序在测定SNP时的常见问题所提出的相应解决方法不仅简单、经济有效,而且在临床应用方面具有可靠性。