胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因PeALD的克隆及耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv)是优良的抗逆树种,有很强的耐盐碱性.前期胡杨转录组研究结果显示盐胁迫可诱导果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因(PeALD)转录上调,提示该基因可能对胡杨耐盐性方面有某种贡献.为分析PeALD基因在胡杨耐盐性中的作用,本研究以胡杨为材料,利用RT-PCR方法克隆了胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因的全长cDNA,通过基因转化法尝试在烟草中过量表达该基因,并对转基因株系的耐盐性进行初步分析.研究结果显示,克隆的cDNA编码果糖-1,6-二磷酸醛羧酶,ORF为1 177 bp,是由247个氨基酸编码的疏水性蛋白,理论等电点为6.84,分子量为26.79 kD.PCR与RT-PCR检测结果表明,外源的PeALD基因通过转化已经整合到烟草的染色体中,并在4个株系中得到较强的表达.转化株系表型筛选实验表明,在200 mmol/L NaCl的MS培养基中培养15 d后,野生型烟草植株无明显高生长,叶片全部黄化并萎缩;而转基因烟草高生长基本没有受到抑制,植株生长良好.说明在烟草中过表达PeALD使转化植株的耐盐性显著提高.光合数据结果显示,ALD基因能够降低盐胁迫对烟草叶片净光合速率的影响,可能是PeALD过表达加速了卡尔文循环的运转,提高了CO2的固定速率,进而促进了光合活性,通过光合作用促进碳的积累,利于呼吸作用和氧化磷酸化产生ATP,为维持跨膜质子浓度梯度提供能量,从而有可能促进质膜上的Na+/H+逆向转运,利于细胞质膜保持拒盐性.这些结果初步验证了PeALD基因的耐盐性功能,为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的作用奠定了良好基础.     

烟草花叶病毒装配起始位点反义RNA表达型中间载体的构建

利用基因工程方法培育抗病毒植物新品种的途径之一,是在植株中建立一个产生病毒基因组功能片段的反义RNA的系统。本工作设计并合成了一段烟草花叶病毒(TMV)装配起始位点反义RNA的基因,再以pBR 325为基本质粒,构建了包含带有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和PolyA信号的反义RNA表达单元,以及为筛选转基因植株所必须的NPT-Ⅱ表达单元的中间载体,为以后经土壤农杆菌而获得转基因烟草植株打下了基础。     

在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸(Pro)合成途径必须的基因B(ProB)。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ(NPT—Ⅱ),可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—~(32)P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮(acetosyringone)125μg/ml和章鱼碱(octopine)125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草(Nicotana tabacum var.Gexin No.1),叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素(K_m)80μg/ml、6—苄基腺嘌呤(6BA)1μg/ml和头孢氨噻腭钠(Cef)500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。     

烟草花叶病毒外壳蛋白的基因导入和转化烟株的再生

用T-DNA区携有嵌合的烟草花叶病毒外壳蛋白基因和卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)的土壤农杆菌株pACK403和pACK404与烟草品种SRl和斯佩特G-28单倍体无菌菌叶碟片进行共培养转化。转化后的叶碟片在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉索300毫克/升的培养基上诱导芽,在含有头孢噻肟钠500毫克/升和卡那霉素100毫克/升的培养基上诱导生根。Nopaline测定,烟草花叶病毒外壳蛋白基因的表达检测、转化烟株对烟草花叶病毒侵染抗性的检测结果证明:用这种方法能可靠地将外源基因导入烟草,并能在转化烟株中表达。再生得到的转化烟株在烟草花叶病毒强感染情况下能延迟病症表现4—25天。     

小麦黄花叶病毒基因组核苷酸序列分析

以小麦黄花叶病毒 (WYMV)HC分离物为材料 ,合成病毒基因组cDNA并进行序列分析 .结果表明 ,病毒RNA1共有 76 2 9个核苷酸 ,编码 1种由 2 40 7个氨基酸组成的多聚蛋白 ,切割产生病毒外壳和其他 7种可能的蛋白质 .该病毒的RNA2共有 36 39个核苷酸 ,编码 1种由 90 3个氨基酸组成的蛋白 ,可能切割产生 2种非结构蛋白 .WYMV虽然与小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)在基因组结构上具有相似性 ,但是两者间在核苷酸及氨基酸水平上的同源性却分别低于 70 %和 75 % .由此结果可以确认 ,WYMV与WSSMV是大麦黄花叶病毒属 (Bymovirus)的 2种不同病毒 .     

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒(fobacco mosaic virus,TMV)和马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV-CP和PVY-CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300-35S-OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功.并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草.     

转望江南核糖体失活蛋白基因cassin烟草及其对烟草花叶病毒的抗性

通过构建植物表达载体,由农杆菌介导,将望江南核糖体失活蛋白基因cassin转入烟草。PCR和Southern blot杂交结果证明：外源基因已经以单拷贝整合到烟草基因组内,并且在后代发生遗传分离。RT—PCR和Northern blot杂交结果显示：外源基因可以正常转录。用不同浓度的TMV机械摩擦接种转基因T1、T2代各3个自交株系,以非转基因烟草为阴性对照,实验结果表明转基因烟草对TMV表现出不同程度的抗性。     

黄瓜花叶病毒CB7株系引起心叶烟坏死反应与RNA2相关

采用RT-PCR获得黄瓜花叶病毒CMV-CB7株系全长基因组cDNA,经克隆测序发现该CMV的RNA1、2和3分别为3356nt、3045nt和2218nt(序列登录号为:EF216866、DQ785470和EF216867).CMV-CB7基因组cDNA克隆体外转录RNA接种心叶烟引起坏死症状,而CMV-Fny则产生典型花叶.由CMV-CB7和CMV-Fny基因组RNA相互交换而构建6个假重组型病毒(C1C2F3、C1F2C3、F1C2C3、F1F2C3、F1C2F3和C1F2C3)活性分析表明:CMV-CB7基因组RNA2决定其在寄主上的症状反应.嵌合型RNA2(RNA2F5C3和RNA2C3F5)的寄主侵染活性测定表明:2b基因或RNA23′端非编码序列决定CMV-CB7在心叶烟坏死症状.RNA印迹分析结果显示:CMV-CB7和CMV-FnyF5C3引起寄主坏死与基因组RNA积累没有直接关系.     

烟叶微生物及其在烟叶发酵和醇化中的作用研究进展

微生物在烟叶发酵和醇化过程中具有十分重要的作用。本文综述了烟叶微生物概况及其在烟叶发酵和醇化中的应用和研究进展。主要介绍了烟叶微生物的区系划分、烟叶发酵和醇化过程中微生物动态变化以及外源添加微生物的应用方法。阐述了微生物在缩短烟叶发酵和醇化周期、改善烟叶品质、降低烟叶有害物质和提高烟叶安全性等方面的研究应用成果。最后,对该领域今后的研究方向提出了展望。     

葡萄蔗糖转运蛋白在烟草中的反义表达及其对转基因烟草的影响

将葡萄蔗糖转运蛋白VvSUC27cDNA以反义方向插入到含有CaMV35s启动子的真核表达载体pBI121载体中,然后转化到烟草(Nicotianatobacumcv.Samsun)植株中.转反义VvSUC27cDNA的烟草植株在含有20g/L蔗糖的培养基上能够正常生长发育,但是通过切片观察,发现其根部发育较弱,且叶片叶绿体含量增加.可溶性糖测定发现,转基因烟草根部蔗糖含量只有野生型烟草的51%.14C蔗糖吸收实验发现转基因烟草转运外界蔗糖的能力大大降低.