NADPH缺陷型Corynebacterium glutamicum重组菌株的构建及其性能分析

[目的]改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中NADPH合成途径,阻断胞内NADPH的合成,获得1株NADPH营养缺陷型菌株。[方法]通过失活L-赖氨酸高产菌C. glutamicum Lys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)并将NADP~+依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP~+-Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcus mutans)中的NAD~+-Icdsm,阻断胞内NADPH的合成。随后结合辅因子工程,引入大肠杆菌(Escherichia coli)中膜结合吡啶核苷酸转氢酶(PntAB)并通过不同强度启动子控制PntAB的表达水平。最后,分析不同重组菌中胞内氧化还原水平和L-赖氨酸生产强度的变化。[结果]重组菌C.glutamicum Lys-χΔZMI_(Cg)::I_(Sm)(即Lys-x1)胞内检测不到NADPH,为1株NADPH营养缺陷型菌株。该重组菌只在以葡萄糖酸为碳源的基础培养基中生长和积累L-赖氨酸,而以葡萄糖、丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸为碳源时无法生长。此外,表达E.coli中的PntAB可回补重组菌Lys-χ1胞内NADPH的水平,但由于不同强度启动子控制PntAB表达水平不同,重组菌胞内NADPH水平也不同,并影响L-赖氨酸的生产强度。[结论]重组菌Lys-χ1可作为有效的底盘细胞,用于考察不同的NADPH再生策略,获得不同胞内NADPH水平的重组菌株,为进一步阐明NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制提供研究基础。     

谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸

【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。     

钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸整合型重组钝齿棒杆菌的构建

[目的]为了构建一株直接利用廉价的葡萄糖合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌,将来自于植物乳杆菌γ-氨基丁酸合成途径的关键酶谷氨酸脱羧酶基因(lpgad)在产谷氨酸菌株钝齿棒杆菌中进行整合表达,实现葡萄糖到GABA的一步法生产.[方法]运用PCR技术扩增得到带有tac启动子的谷氨酸脱羧酶基因tacgad.通过重叠PCR的方法获得钝齿棒杆菌精氨酸合成途径关键酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)基因内部缺失型基因△argB.利用自杀载体pK18mobsacB构建同源整合载体pK18-△argB::tacgad,以△argB的上下游序列为同源臂,通过两次同源重组将tacgad基因整合到钝齿棒杆菌基因组,同时将NAGK基因argB灭活,利用蔗糖致死基因sacB反向筛选标记筛选得到谷氨酸脱羧酶的重组钝齿棒杆菌C.crenatum △argB::tacgad.重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物进行发酵,测定GABA含量.[结果]重组菌C.crenatum △argB::tacgad成功表达谷氨酸脱羧酶,同时阻断了精氨酸合成途径对谷氨酸到GABA代谢途径的竞争,粗酶液基本检测不到NAGK活性,发酵液无精氨酸合成.通过96 h发酵,重组菌可积累约8.28 g/L的GABA.[结论]本研究通过将谷氨酸脱羧酶基因定向整合到钝齿棒杆菌精氨酸合成途径的关键酶基因argB内部,成功表达谷氨酸脱羧酶的同时阻断竞争途径精氨酸的合成.本研究为实现直接利用葡萄糖合成GABA的一步法生产奠定了基础.     

青藏高原长花马先蒿的细胞地理学研究

对青藏高原长花马先蒿9个居群的核型及细胞地理学进行研究,所有居群的染色体数目均为2n=16,染色体基数为x=8。现有的细胞学资料表明:分布于云南中甸的居群可能为较原始的类群,而分布于西藏日土和青海门源的居群较为进化。长花马先蒿的9个居群均为二倍体,并未出现多倍化现象,可能是由于在末次冰期青藏高原存在广泛的避难所,二倍体得到很好的保存,冰期对它们的影响不是很大; 也可能是对环境的选择压力造成的。     

袁河花个体繁殖力研究

对采自江西省袁河的68尾花个体繁殖力及其与生物学指标的关系进行了研究。结果表明,体长在11.0～28.5cm、体重在27.3～418g的个体,绝对繁殖力(F)为540～47477.06粒,相对体长繁殖力(FL)和相对体重繁殖力(FW)分别为31.40～1683.96粒/cm、5.82～249.17粒/g,F、FL与年龄、体长、体重、体长×体重、净体重、卵巢重和成熟系数显著相关,FW与卵巢重和成熟系数显著相关;个体绝对生殖力与各指标逐步回归方程为:F=20062.53+604.307Wg+244.982W-1365.731L-134.223W0-4183.265K(R2=0.935,n=68),经卵径分布频数图初步推断,袁河花为一次产卵鱼。     

绵地花菌(Albatrellus ovinus)中的grifolin及其衍生物

本文对高等真菌绵地花(Albatrellus ovinus)进行了化学成分的研究。利用各种柱色谱方法(包括正相硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20凝胶色谱、中压液相色谱、半制备HPLC等),分离得到grifolin及其它的5个衍生物。分别为grifolin(1)、neogrifolin(2)、grifolinone A(3)、grifolinone C(4)、confluentin(5)和4-O-methylgrifolic acid(6)。这些化合物的结构通过波谱学方法以及与文献数据对照进行确定。化合物3～6为首次从该种高等真菌中分离得到。化合物4为一个真菌色素,它是一个由一分子的grifolin和一分子苯醌化的grifolin以头对头的方式聚合而成的二聚体。     

岷江上游山地牧道与锥花小檗种群特征的关系

以干旱河谷/山地森林交错带的锥花小檗灌丛为对象,采用跟踪放牧和野外调查的方法获取家畜生境利用和牧道分布特征,并使用RDA排序筛选出影响牧道分布的主要因子,探讨牧道特征与锥花小檗盖度、大小级和分布格局的关系.结果表明:牧道分布能够直观反映家畜的生境利用特点,并与跟踪放牧结果一致;5 m尺度的Morisita指数能客观地反映牧道的分布类型,样地1、2和6呈集群分布,其他样地呈均匀分布;在坡面尺度上,灌丛盖度、灌丛高度与牧道特征呈负相关,为显著影响因子;锥花小檗种群盖度和牧道面积呈显著负相关;种群结构与牧道分布密切相关,锥花小檗灌木长轴和短轴比平均为1.29,灌木形状趋近于圆形,牧道景观及牧道上的放牧家畜对灌木具有塑形作用;锥花小檗种群和牧道Morisita指数指向性一致,但实际上两者呈反向分布,灌木斑块或集聚或均匀分布于偏离牧道的区域.     

甘蓝型油菜下胚轴和带柄子叶再生体系研究

以甘蓝型油菜野油19号的下胚轴和带柄子叶为外植体,研究其下胚轴和带柄子叶在不同浓度激素配比下的分化率及再生频率的变化。该品系的油菜下胚轴和带柄子叶在1.5 mg/L的2,4-D中预培养4 d后,转入分化培养基中,其愈伤组织形成早,发生快,再生频率和分化频率均较高。其中,下胚轴转入MS+3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中的分化率和再生频率最高,再生频率达到86.67%;带柄子叶外植体的再生频率要比下胚轴的再生频率低,在MS+4 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的分化培养基中芽的再生频率为46.67%。本研究初步建立了甘蓝型油菜野油19号的高频率再生体系。     

腺花香茶菜地下根茎化学成分研究

采用硅胶、RP-18等柱色谱,从腺花香茶菜地下根茎70%丙酮提取物的乙酸乙酯部位分离得到16个化合物,通过理化性质和波谱数据分别鉴定为维西香茶菜甲素(1)、2α-羟基齐墩果酸(2)、2α,23-二羟基齐墩果酸(3)、2β,3β-二-O-异丙叉基-齐墩果-12-烯-28-酸(4)、乙酰熊果酸(5)、1-棕榈酸单甘油酯(6)、1-油酸单甘油酯(7)、1-亚油酸单甘油酯(8)、1,2-亚油酸甘油二酯(9)、α-亚麻酸甲酯(10)、棕榈酸(11)、硬脂酸(12)、油酸(13)、7α-羟基豆甾醇(14)、7β-羟基谷甾醇(15)、β-谷甾醇(16)。化合物4、6～10和13～15为首次从该属植物中分离得到,化合物2、3、5、11和12为首次从该植物中分离得到。