超抗原SEA与抗黑色素瘤ScFv融合基因的构建及表达

采用酶切连接和重叠PCR连接两种方法将抗黑色素瘤单链抗体基因和去除N端信号肽的金黄色葡萄球菌肠毒素A基因进行融合,并将融合基因克隆于pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用NiNTA系统对表达产物进行分离、纯化。MTT法检测融合蛋白对黑色素瘤细胞的体外抑制率。结果表明6HisScFvSEA融合蛋白可在E.coli BL21(DE3)中稳定表达,表达量占菌体蛋白的30%,主要以包涵体的形式存在。融合蛋白可通过激活效应细胞对表达相关抗原的黑色素瘤细胞发挥抑制作用。     

金黄色葡萄球菌核酸酶C末端去9肽对酶蛋白溶液构象的影响

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶（含149个氨基酸残基）,酶蛋白1－140片段（SNase140)以及在TMP（thymidine 5′-monophosphate)和Ca^2 存在下的SNase140的溶液构象状态。探讨了酶蛋白C末端去9肽后对酶蛋白构象和活力的影响。研究指出,远离酶蛋白活性部位残基间相互作用的变化,将通过酶蛋白两个亚结构域之间所形成的氢键,影响酶蛋白活性部位的空间构象,从而影响酶蛋白的活力。     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌a-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌a-溶血素蛋白为研究对象, 分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物, Bradford法测定蛋白含量, 兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带, 达电泳级纯度。与此同时, 凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%, 蛋白含量为0.337 mg/mL, 溶血活性为1519 HU/mg; 镍柱亲和层析的纯化率为17.5%, 蛋白含量为0.35 mg/mL, 溶血活性为1463 HU/mg。由此可见, 凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。     

肽酶PepT参与副溶血弧菌的浮游运动和生物被膜形成

pepT基因编码一种金属依赖性肽酶T (peptidase T,PepT),能特异性催化三肽N端氨基酸,因此也称为氨肽酶T。研究发现大多数氨肽酶参与细菌蛋白质新陈代谢和调节三肽活性,但关于PepT在细菌毒力及致病性方面的报道较少。[目的]本文选取PepT为研究对象,研究其对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建缺失株ΔpepT和回补株CΔpepT,比较菌株在运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性等方面的差异。[结果]与野生株相比,ΔpepT缺失株的极性鞭毛转录水平极显著下降,浮游运动能力降低;同时生物被膜形成能力减弱,而细菌群集运动及环境耐受能力无显著差异。此外,缺失pepT基因会导致副溶血弧菌的细胞毒性和小鼠毒力作用显著下降。[结论]pepT基因与副溶血弧菌浮游运动和生物被膜形成能力相关,并且影响其致病性。     

金黄色葡萄球菌引起食物中毒的作用机制与其耐药性的研究进展

葡萄球菌广泛分布于自然界中,如空气、土壤、水以及物体的表面,在人和动物的皮肤表面部、鼻咽、肠道也常可发现葡萄球菌。大部分葡萄球菌是非致病菌,少数可引起人或动物致病,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,金葡菌）即为最主要的致病性葡萄球菌。金葡菌是一种革兰氏阳性球菌,是医院感染常见的病原体之一,同时也是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌,其产生的毒素可使人中毒,带来非常严重的公共卫生负担。本文拟对金葡菌的病原与病理学特性,金葡菌与食物中毒,抗生素滥用与金葡菌耐药性等方面做简要综述。     

几种鳞毛蕨科药用蕨类植物的抑菌特性分析

研究了6种鳞毛蕨科药用蕨类植物的不同浸提液对几种常见微生物生长的影响情况,结果表明它们普遍表现了很好的抑菌效果,其中对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制效果最好,最大的抑菌率达到90.4%;通过对鳞毛蕨科3个属的抑菌作用比较,耳蕨属(Polystichum)的普遍抑菌作用占优势;从浸提方法上看,醇提取的方法并不比水提取的方法有明显的优势.     

生物破乳剂产生菌的筛选及其方法研究

针对生物破乳剂产生菌筛选难的问题, 采用显色法、溶血细胞测试法、表面张力测定法和排油圈法从6种不同菌源对生物破乳菌产生菌进行了筛选。通过试验筛选得到了17株生物破乳剂产生菌, 其中24h内破乳率高于70%的破乳菌有5株; 油田含油污泥、采油废水生物处理污泥和污水处理厂剩余污泥是筛选破乳菌的较好的菌源; 显色法、溶血圈法存在检测范围的局限性; 表面张力测定法和排油圈法是最为简易和准确的生物表面活性剂产生菌的筛选方法, 采用模型乳状液对生物破乳剂产生菌进行筛选最为直接和准确, 但工作量大、所需时间长, 因此在筛选高效破乳菌时, 建议采用表面张力、排油圈法进行初筛, 而后通过模型乳状液破乳进行验证。     

中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT-GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid-GFPTAccM, Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4。SDS-PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid-GFPTAccM的细胞表达产物在约为34 kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Western blotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4中进行了成功的表达。     

单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了深入研究单核增生性李氏杆菌(LM)致病机理,从其基因组中克隆李氏杆菌溶血素基因hly,并将其与原核表达载体连接在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的李氏杆菌溶血素(LLO)融合蛋白,经镍柱纯化得到重组LLO蛋白作为免疫原并免疫小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得3株稳定分泌针对LLO蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为Anti-LLO1、Anti-LLO2、Anti-LLO3;经ELISA测定其细胞培养上清效价分别为1:3.6×104、1:6.4×104、1:1.6×104,腹水效价分别为1:2×107、1:2×107、1:1×107;亲和力解离常数(Kd)分别为6.18×10-11、7.50×10-11、6.27×10-11;3株单抗的IgG亚类均为IgG1。经Westernblotting鉴定证明,该3株抗体均能特异地识别李氏杆菌LLO蛋白,该单抗的制备为深入研究LM的致病机理奠定了基础。