基因体外诱变的一种新方法--脱氧核苷三磷酸替代法

在PCR的过程中,采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的方法,对克隆的野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变.结果表明,BrdUTP浓度越高,诱变越强;浓度越低,诱变越弱.当BrdUTP浓度为dTTP的0.1%时,可以得到最多的正诱变结果.用LBSP鉴别培养基初筛,然后用Yoo改良法测定酶活,仅一轮诱变就获得了其表达产物α-淀粉酶的酶活分别降低了5倍和提高了20倍的两个突变基因.再以后者为PCR模板进行第二轮诱变,从而筛选到了α-淀粉酶的酶活提高40倍的突变体.此诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题,并为基因的体外诱变找到了一条新途径.     

RT—PCR测定mRNA的荧光定量分析

利用反转录毛细管ＰＣＲ技术,可合成代表特异ｍＲＮＡ的双链ＤＮＡ。在一定循环数内,ＰＣＲ产物的量与其模板ｃＤＮＡ即反转录中相应ｍＲＮＡ的浓度有关。溴乙锭嵌入ＤＮＡ双螺旋后,其荧光量子产率大为增加,因此可通过利用处在适当ＰＣＲ循环数中的ｃＤＮＡ浓度与在优选的激发光谱发现射波长下其荧光强度的线性关系,计算出所检测的ｍＲＮＡ表达量。     

亚致死浓度溴虫腈和毒死蜱对等钳蠊螨生长繁殖和解毒酶的影响

【目的】害虫综合治理中,化学防治对天敌资源也具有一定的杀伤力。为缓解这一矛盾,本研究旨在探究溴虫腈和毒死蜱亚致死浓度处理对等钳蠊螨Blattisocius dentriticus生长繁殖及解毒酶活性和基因表达量的影响。【方法】利用药膜法处理2-3日龄等钳蠊螨成螨24 h,测定溴虫腈和毒死蜱的亚致死剂量;测定和比较LC₁₀和LC₃₀剂量这两种药剂处理后F₀和F₁代的产卵量、产卵期、卵孵化率和雌成螨寿命等生物学特性的变化;通过酶活力分析和RT-PCR分别测定LC₁₀, LC₃₀和LC₅₀剂量下这两种药剂处理后钳蠊螨成螨体内谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)酶活力及其基因表达量变化。【结果】溴虫腈和毒死蜱处理24 h对等钳蠊螨成螨的LC₅₀分别为4...     

意大利蜜蜂胸部肌肉的胚后发育

【目的】通过对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称"意蜂")胸部肌肉胚后发育过程组织结构特点的比较研究,为动物肌肉的发育及病理学的研究提供一定的理论证据,也为昆虫作为肌肉再生便利模型的可能性提供理论基础。【方法】通过HE染色和BrdU免疫组织化学染色技术,对意蜂胸部肌肉系统的胚后发育过程及组织结构特点进行观察和比较。【结果】意蜂幼虫胸部的肌肉源于胚胎发育过程中形成的成肌细胞,肌肉的发育是通过融合型成肌细胞和奠基细胞的融合以及成肌细胞和肌细胞的分裂增殖完成的。在意蜂蛹发育早期,大部分的幼虫肌肉退化消失。成虫胸部的肌肉源于2个成肌细胞群的3个成肌细胞巢,其中,背纵肌主要源于背侧扇形细胞群的1个成肌细胞巢,其他肌肉源于腹侧纺锤形细胞群的2个成肌细胞巢。成肌细胞巢中的成虫成肌细胞不断地分裂增殖,形成的细胞向特定的方向扩展、延伸,并生成肌丝,形成肌纤维,最后多个肌纤维形成肌肉束,并最终构成成虫胸部的全部肌肉。【结论】意蜂幼虫和成虫的肌肉具有不同的发育方式,肌肉的形成模式同果蝇存在差异。     

2-溴棕榈酸调节背根神经节中ASIC3蛋白的膜定位缓解大鼠骨癌痛

骨癌痛（BCP）是恶性肿瘤患者最常见的疼痛之一,严重影响患者的生活质量。BCP的分子作用机制和新药研发都迫在眉睫。2-溴棕榈酸（2-BP）作为一种蛋白质棕榈化抑制剂在病理性疼痛中有镇痛效果,而在骨癌痛中作用仍不清楚。酸敏感离子通道3型（ASIC3）,作为一个重要的疼痛因子能否受到2-BP的调控也未知。为了检测2-BP在骨癌痛中的作用,并研究其对背根神经节（DRG）中ASIC3的调控,本文开展了相关工作。1）首先建立BCP大鼠模型,将大鼠乳腺癌细胞（MRMT-1）注射入雌大鼠胫骨骨髓腔内,21 d后通过X射线和机械痛检测,发现与假性手术组相比,BCP模型大鼠的胫骨被破坏;同时,BCP组大鼠的机械疼痛值明显上升（假性手术组PWT vs. BCP PWT:16.1 ± 1.5 vs. 5.3 ± 1.5; P<0.01）;表明大鼠乳腺癌骨转移疼痛模型成功构建。2）蛋白质免疫印迹检测结果显示,与正常和假性手术组相比,BCP大鼠L4-L6 DRG中酸敏感离子通道3蛋白表达上调（0.63 ± 0.03, 0.64 ± 0.1 和 1.07 ± 0.05）。3）在术后第21 d,给BCP大鼠腹腔注射2-BP,发现给药组BCP大鼠的机械疼痛值下调 （6 h后,PWT 对照 vs. PWT 2-BP: 6.9 ± 2.0 vs. 10.8 ± 1.6, P<0.01）,表明2-BP在骨癌痛模型大鼠中具有镇痛作用。4）蛋白质免疫印迹结果显示,与给药前相比,2-BP处理后降低了BCP大鼠L4-L6 DRG中膜上ASIC3蛋白的表达（1.05 ± 0.13, 0.66 ± 0.12）。同时,在ASIC3介导的酸痛模型中,2-BP给药降低大鼠震颤的次数（对照组为27 ± 1.8次,2-BP组为10 ± 1.5次）,表明2-BP给药阻断ASIC3介导的酸痛。5）在ASIC3转染的SH-SY5Y细胞中,与对照相比,2-BP给药后明显降低膜上ASIC3蛋白表达量（1.0 ± 0.2, 0.58 ± 0.10）。这些结果表明,2-BP在骨癌痛中具有镇痛作用,其镇痛机制涉及到调控背根神经节中膜上酸敏感离子通道3的表达。     

线粒体靶向TPP-DOX连接物的制备及其逆转肿瘤耐药活性研究

目的:阿霉素(DOX)是常用的抗肿瘤药物,但是它的毒副作用大,而且肿瘤细胞易对DOX产生耐药,限制了其临床应用。本研究利用肿瘤细胞线粒体跨膜电位较高的特性,将亲脂性阳离子(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)与DOX相连接制备具有线粒体靶向功能的TPP-DOX,以期达到逆转肿瘤细胞耐药的目的。方法:以DOX、TPP为原料,合成TPP-DOX,通过核磁、质谱等方法进行结构鉴定。采用MTT方法研究TPP-DOX对KB细胞、A549细胞及耐DOX肿瘤细胞MDA-MB-231/ADR的体外抗肿瘤活性。采用激光共聚焦显微镜观察TPP-DOX在肿瘤细胞内的分布。结果:TPP-DOX对KB细胞和A549细胞的毒性低于DOX,TPP-DOX对耐DOX肿瘤细胞MDA-MB-231/ADR的毒性明显大于DOX。激光共聚焦显示TPP-DOX分布于细胞核和线粒体中。结论:TPP-DOX具有线粒体靶向特性,可有效逆转肿瘤耐药,有进一步研究的价值。     

吲哚氰绿排泄试验评价肝储备功能与拔管时间的研究

目的:术前评估肝硬化患者肝脏储备功能,及其与患者拔管时间及改良OAA/S评分的关系.方法:对60例肝硬化失代偿患者术前行吲哚氰绿排泄试验.将患者分为三组:按吲哚氰绿15 min储留率(ICGR15)将患者分为两组I1组,I2组,另30例肝功能正常患者为对照组(C组).观测ICGR15与患者拔管时间及改良OAA/S评分的关系.结果:拔管时间I1组与I2组均明显长于C组(P＜0.05或P＜0.01);发生呕吐,烦躁者I1组与I2组均明显多于C组(P＜0.05或P＜0.01),OAA/S评分＞3分者I1组与I2组均多于C组,但无统计学意义.结论:ICGR15对于判断肝硬化患者围术期拔管的时间具有一定的参考价值.     

溴结构域蛋白4的结构和功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain, Bet)家族是表观基因组的调节因子,也是肿瘤细胞生存所依赖的肿瘤相关基因表达的关键驱动因子。溴结构域蛋白4 (bromodomain-containing protein 4, Brd4)是溴域和端外蛋白家族中的一员,通常识别乙酰化组蛋白,并定位于目的基因的启动子或增强子区域,启动并维持肿瘤相关基因的表达。Brd4与多种转录因子调控和染色质修饰密切相关,并参与DNA损伤修复、维持端粒功能,从而维持肿瘤细胞的存活。本文围绕Brd4蛋白的结构、功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用进行综述。     

益肺胶囊联合乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂对COPD稳定期患者肺功能、细胞免疫功能和血清bFGF、SIRT1的影响

摘要 目的：探讨益肺胶囊联合乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂对慢性阻塞性肺疾病（COPD）疾病稳定期患者肺功能、细胞免疫功能和血清碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、沉默信息调节因子1（SIRT1）的影响。方法：纳入我院2021年3月~2022年6月期间收治的COPD稳定期患者104例,按照随机数字表法分为对照组（乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂治疗,n=52）和观察组（益肺胶囊联合乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂治疗,n=52）。对比两组临床症状恢复时间、6 min步行试验（6MWT）和COPD评估测试（CAT）评分、肺功能[第1秒用力呼气容积（FEV1）、用力肺活量（FVC）、每分钟最大通气量（MVV）]、细胞免疫功能和血清bFGF、SIRT1水平,观察两组不良反应发生情况。结果：与对照组相比,观察组的肺啰音、咳嗽、咯痰消失时间缩短（P<0.05）。与对照组相比,观察组治疗14 d后6MWT更远,CAT评分更低（P<0.05）。与对照组相比,观察组治疗14 d后FVC、FEV₁、MVV更高（P<0.05）。与对照组相比,观察组治疗14 d后CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺更高,CD8⁺更低（P<0.05）。与对照组相比,观察组治疗14 d后bFGF更低,SIRT1更高（P<0.05）。两组不良反应总发生率组间对比无差异（P>0.05）。结论：益肺胶囊联合乌美溴铵维兰特罗吸入粉雾剂有助于调节COPD稳定期患者血清bFGF、SIRT1水平,改善肺功能和细胞免疫功能。     

溴虫氟苯双酰胺对草地贪夜蛾的亚致死效应

为明确溴虫氟苯双酰胺对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的亚致死效应,采用点滴法测定溴虫氟苯双酰胺对草地贪夜蛾3龄幼虫的室内毒力及亚致死剂量溴虫氟苯双酰胺(LD₁₅和LD₃₀)对草地贪夜蛾生物学特性的影响,同时测定了亚致死剂量(LD₁₅、LD₃₀)和半致死剂量(LD₅₀)溴虫氟苯双酰胺对草地贪夜蛾3龄幼虫体内解毒酶(GST、EST、MFO)、保护酶(SOD、POD、CAT)活性的影响。结果表明,溴虫氟苯双酰胺对草地贪夜蛾3龄幼虫具有良好的触杀活性,LD₅₀值为0.50μg/g。亚致死剂量(LD₁₅和LD₃₀)溴虫氟苯双酰胺处理草地贪夜蛾3龄幼虫后,幼虫存活率显著下降,较对照分别下降了6.7%和32.88%;LD₃₀处理的成虫畸形率(8.33%)较对照(1.75%)显著升高,产卵前期(3.31 d)较对照(2.88 d)显著延长。溴虫氟苯双酰胺3个不同剂量(LD_15...