快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。     

胃底腺息肉与胃增生性息肉的临床、内镜特征分析

目的:分析胃底腺息肉与胃增生性息肉的临床、内镜下等特点。方法:回顾性搜集胃镜检出的经病理证实的胃底腺息肉和胃增生性息肉393例纳入分析,按年龄、性别、发生部位、大小、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)感染状态、是否使用质子泵抑制剂(proton pump inhibitor)等因素进行分析比较。结果:393例增生性息肉与胃底腺息肉中,男178例,女215例,男女比例为1:1.2,年龄28~89岁。随着年龄的增高,胃息肉发生率越高,但各年龄段分布差异无统计学意义(P>0.05)。不同部位的增生性息肉与胃底腺性息肉大小相比差异有统计学意义(P<0.05)。两种胃息肉的性别分布差异有统计学意义(P<0.05)。增生性息肉H.pylori感染率较胃底腺性息肉高(P<0.05),而胃底腺息肉质子泵抑制剂使用率较胃增生性息肉高(P<0.05)。结论:增生性息肉与幽门螺旋杆菌感染有关,胃底腺息肉与质子泵抑制剂使用有关。对胃底腺息肉与胃增生性息肉的临床、内镜特点的分析有助于胃镜检查对胃息肉性质的初步判断,提高诊断的准确性。     

FrzA基因转导干预缺血性心力衰竭小鼠心肌Wnt信号通路的研究

目的:研究重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)携带FrzA基因转导干预缺血性心衰小鼠心肌Wnt信号通路的可行性,为基因治疗心力衰竭提供新的思路.方法:选择3月龄雄性C57BL/6J小鼠共130只,随机分为空白组(n=10),心衰组(n=40),心衰+空病毒(rAAV9-GFP)注射组(n=40),心衰+rAAV9-FrzA组(n=40),采用结扎左冠状动脉定量控制心梗面积,于术后2周行心脏超声评各组心功能变化,再经尾静脉注射已稀释好的病毒,28d后处死小鼠取心脏标本,RT-PCR检测心肌目的基因FrzA以及Dvl-1,β-catenin的表达;Western blot检测心肌Wnt信号通路关键分子Dvl-1,GSK3β,p-GSK3β,β-catenin的表达.结果:与空白组相比,成功建立心衰模型后小鼠心功能均不同程度降低(P＜0.05);FrzA组与心衰组相比,心功能明显改善(P＜0.05);经尾静脉注射可成功将rAAV9-FrzA导入小鼠体内,并且目的基因FrzA在心肌组织中高表达(P＜0.05);心衰小鼠心肌中Wnt信号通路关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin的表达显著升高(P＜0.05),FrzA转导后小鼠心肌中Wnt信号通路中关键分子Dvl-1,p-GSK3β,β-catenin表达均降低(P＜0.05)结论:利用rAAV9-FrzA转导缺血性心衰小鼠可以有效的干预心肌Wnt信号通路,抑制其活性,为基因治疗缺血性心衰提供了新的思路.     

化学修饰的重组腺相关病毒载体

重组腺相关病毒(Recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)载体源于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),以其无致病性、低免疫原性、可定点整合及在宿主细胞内长期表达等优势,广泛应用于肿瘤和遗传疾病等基因治疗研究,被视为最有前途的基因治疗载体之一。但是人体内广泛存在AAV中和抗体,以及rAAV对体内特定组织或细胞的靶向性欠理想,限制了其在临床上的应用。经化学修饰的rAAV可以抵御血清中和抗体,提高转导靶向性,还可实现rAAV体内动态监测,这为解决当前rAAV载体的问题提供了新的思路和方法。本文对化学修饰的rAAV展开系统阐述,并对其未来发展趋势作出展望。     

人肺腺癌细胞A—549和正常细胞HBE的蛋白质组差异分析

为了研究人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组差异 ,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人肺腺癌细胞系A 5 49和正常细胞HBE的总蛋白质 ,银染显色 ,PDQuest 2 DE软件分析 ,对部分差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱 ,图象分析探测到A 5 492 DE图谱的平均蛋白质点数为 (890± 38)个 ,HBE的平均蛋白质点数为 (75 7± 2 7)个 ,不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为 (2 .85± 0 .48)mm ,在SDS PAGE方向为 (2 .6 9± 0 .37)mm。差异表达分析发现A 5 49和HBE图谱有5 35个蛋白质点相互匹配 ,其中A 5 49有 35 5个未被匹配 ,HBE中有 2 2 2个未被匹配 ;对A 5 49和HBE中的 18个差异蛋白质点分别进行肽质指纹分析 ,经数据库查询 ,初步鉴定为一些与物质代谢、细胞因子、信号转导有关的蛋白质。提示人肺腺癌细胞A 5 49和正常细胞HBE的蛋白质组具有差异 ,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究肺腺癌的相关蛋白质及分子标记物     

河川沙塘鳢孵化腺的发生及孵化酶的分泌

利用光学显微镜和扫描电镜观察了河川沙塘鳢Odontobutis potamophila(Gnther)孵化腺的发生及孵化酶的分泌过程。河川沙塘鳢的孵化腺为单层细胞腺体,发生于外胚层。孵化腺(Hatching gland,HG)最早发生自眼晶体形成期的胚胎,初发生时孵化腺细胞(Hatching gland cells,HGCs)分布于头部腹面及其与卵黄囊连接处。随着胚胎的发育,HG仍以单层细胞分布于胚体和卵黄囊的外表面,HGCs数量急剧增多,细胞体积增大,分布范围更加广泛。至眼黑色素出现期的胚胎,HGCs的数量达到大约900-1200个,广泛分布于胚胎头部两侧、头部腹面及其与卵黄囊连接处、卵黄囊的前腹面。HGCs大多呈椭圆形,短径为5-8μm,长径为7-12μm,在HE染色中呈粉红色。至孵化前期时,孵化酶颗粒自HGCs顶部的开口分泌出来,分泌颗粒呈圆球形,直径为0.5-1.0μm,有的以单体的形式存在,有的粘结成团。孵化酶进入卵周液,对卵膜内层进行消化和降解,使胚胎破膜而出。孵化后2d,HGCs便从表皮中消失。     

双丁酰cAMP对人体肺腺癌细胞表面凝集素受体及其侵袭能力的影响

着重观察双丁酰ｃＡＭＰ对培养的人肺腺癌细胞膜上多种凝集素受体表达的影响,并将体外经双丁酰ｃＡＭＰ处理的癌细胞接种于裸鼠皮下,观察移植瘤自发性生长状况。结果表明,经双丁酰ｃＡＭＰ处理的人肺腺癌细胞表面ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＵＥＡ－１、ＤＢＡ、ＣｏｎＡ凝集素受体表达降低,同时伴有移植瘤成瘤潜伏期延长,侵袭能力下降。结果提示双丁酰ｃＡＭＰ导致的癌细胞表面数种凝集素受体的表达下降,可能是恢复癌细胞间粘附识别能力、降低其侵袭力的机制之一     

动物气味的顶空取样技术及其在水貂肛腺成分分析中的应用

我们设计了一种用于动物气味的顶空 (headspace)取样装置 ,并结合溶剂解吸附和气质联用技术 ,通过对水貂 (Mustelavision)肛腺分泌物的挥发性成分的分析验证这种装置的可行性。出现 5个气谱峰 ,对应的质谱显示其分子量和分子式依次为峰 1:10 2 (C5H10 S)、峰 2 :10 4(C5H12 S)、峰 3:10 2 (C5H10 S)、峰 4:136(C5H12 S2 )和峰 5 :134 (C5H10 S2 )。峰 1、峰 3和峰 5分别为以前研究所鉴定出的 3种主要成分 :2 ,2 二甲基硫代环丁烷、2 乙基硫代环丁烷和 3,3 二甲基 1,2 二硫代环戊烷 ,2 ,2 二甲基硫代环丁烷为优势成分 ,组成无性别间差异。这些结果与以前研究一致 ,说明了这种顶空取样装置的可靠性。峰 2和峰 4两种成分以前在水貂肛腺中未曾发现 ,初步分析可能分别为 3 甲基 1 丙基硫醇和 1,5 戊二硫醇。尽管这两个成分有待进一步分析确定 ,但可以肯定分子量为 10 4和 136的成分不仅在水貂肛腺分泌物中没有发现过 ,而且在已经研究过的鼬属动物和食肉类的肛腺中都未发现过 ,能检测出更多的成分 ,说明这种方法的可靠性很高。     

达乌尔黄鼠冷暴露、冬眠及激醒时的外周甲状腺激素水平变化

探讨了达乌尔黄鼠在冷暴露、冬眠及激醒时的外周甲状腺激素水平变化和激素代谢。达乌尔黄鼠在非冬眠季节 ( 7～ 8月 )冷暴露 ( 4℃± 2℃ ) 1天 ,导致血清T3和T4浓度迅速增加 ,T3/T4不变 ;经 4周冷驯化后 ,T3维持在高水平上 ,T4降低 ,T3/T4增加 ,外周组织中的T4脱碘酶活性升高。表明冬眠动物与非冬眠动物的甲状腺机能及其激素代谢的冷适应性调节一致。在冬眠季 ( 12～ 1月 )的冬眠和激醒过程中 ,外周组织的T4脱碘酶活性、血清T3和T4水平比常温达乌尔黄鼠的高 ,显著高于夏季的水平 ,T3/T4不变。表明达乌尔黄鼠甲状腺机能及其激素水平存在季节性变化。