PCR产物直接测序还是克隆测序 密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属（Athrotaxis）植物rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列进行了测定与分析。实验表明A. selaginoides rDNA重复序列间的纯合程度很高, 对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A. laxifolia、A. cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低,各重复单位间序列存在插入/缺失,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A. laxifolia、A. cupressoides的ITS2区尽管也存在 多态性,但不同重复序列的浓度比较平均,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同,同一植物ITS的不同区域,其重复序列间的纯合程度也不同,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

基因测序技术的发展以及对个体化用药水平提高的影响

自基因测序技术发明之时起,就已开始运用在生命科学的研究中,对揭示生命本质的研究起到了关键作用。基因测序技术的运用推动了生命科学的发展,并由此引申了更多的科学问题;人们对未知领域的渴求又推动了基因测序技术的进步,发展出更高速、更低价的新技术。随着测序技术的逐步应用,临床个体化用药的水平有了极大的提高。基因测序技术目前已经成功应用于遗传基因多态性标志物的筛选中,使基因导向的合理用药成为可能;还成功应用于疾病组织突变位点标志物的筛查中,使肿瘤靶向用药成为可能;在病原体耐药基因突变检测中的应用,使基于细菌或病毒耐药突变的个体化用药成为可能。随着测序技术向更高通量、更高精度、更低成本的方向发展,基于基因检测的个体化健康时代将会到来。     

分类学中的新生长点——植物分子系统学

１９８１年，美国加利福尼亚大学Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ分校的迈克尔·克莱格ＭｉｃｈａｅｌＣｌｅｇｇ博士利用他的休假期到澳大利亚堪培拉ＣＳＩＲＯ的一个实验室访问，并提出了一项研究计划，即利用叶绿体ＤＮＡ的ＲＦＬＰ分析探讨现代和古代大麦栽培型之间的关系。与克莱格在同一个实验室作访问学者的杰拉德·佐拉斯基（ＧｅｒａｒｄＺｕｒａｗｓｋｉ）也来自加州，他刚刚完成了对菠菜的ｒｂｃＬ基因测序，而下一个材料是豌豆。在非常偶然的一次谈话中，佐拉斯基向克莱格建议：“ＲＦＬＰ分析固然不错，但何不尝试比较一下大麦叶绿体基…     

炎性因子IL6的缺失对C57BL/6鼻咽部细菌群落组成的影响

目的研究炎症因子IL-6缺失是否影响鼻咽部菌群组成。方法提取鼻咽部灌洗液DNA并进行扩增子测序检测IL-6敲除前后鼻咽部菌群,分析菌群α多样性,并使用Wilcoxon秩和检验分析差异菌群。通过PICRUSt对菌群OTU丰富度表进行标准化,然后进行菌群关联的KEGG分析。结果 IL-6基因敲除后鼻咽部菌群丰富度和多样性变化不明显,但菌群组成发生明显变化。丰富度前15个属中9个属明显变化,有6个属明显下降,3个属明显上升。其中,Streptococcus和Bergeyella丰富度明显升高,Staphylococcus、Rothia和Corynebacterium_1丰富度明显降低。Real time PCR检测种水平发现IL-6敲除后Staphylococcus lentus丰富度明显降低。菌群KEGG分析发现,IL-6敲除后,炎性功能相关的脂肪细胞因子信号通路表达下调、细胞凋亡通路表达上调,另外,部分抗病毒活性通路表达上调。结论炎性因子IL-6与鼻咽部菌群组成存在明显相关性,菌群KEGG分析发现IL-6敲除后多个炎性功能相关通路表达受到影响。     

慢传输型便秘患者肠道粪便菌群的变化特征

目的通过16S rDNA高通量测序技术,研究慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)患者粪便菌群的变化特征。方法选取12例慢传输型便秘患者(STC组)及12例健康志愿者(对照组),留取粪便标本后,应用16S rDNA高通量测序技术对标本进行测序,并分析测序结果。结果 STC组与对照组人群肠道在菌群物种种类(Chao1指数和Sobs指数)上差异存在统计学意义(Z=-2.771,P=0.006;Z=-2.425,P=0.015),对照组人群肠道菌群物种种类明显高于STC组;两组在物种均一性(Shannon指数、Simpson指数)上差异无统计学意义(Z=-0.520,P=0.603;Z=-0.348,P=0.728)。在门水平,两组人群粪便菌群多样性差异无统计学意义。在属水平,Phascolarctobacterium(Z=-2.194,P=0.028)、Streptococcus(Z=-4.157,P0.001)、Eggerthella(Z=-2.427,P=0.015)和Actinomyces(Z=-2.310,P=0.021)在STC组人群肠道中相对丰度增加,而Faecalibacterium(Z=-2.887,P=0.004)、Roseburia(Z=-3.118,P=0.002)、Sphingomonas(Z=-4.157,P0.001)、Variovorax(Z=-2.732,P=0.006)、Holdemania(Z=-1.970,P=0.049)、Phyllobacterium(Z=-2.732,P=0.006)、Pseudomonas(Z=-2.439,P=0.015)、Acinetobacter(Z=-2.732,P=0.006)、Aquabacterium(Z=-2.134,P=0.033)和Novosphingobium(Z=-2.134,P=0.033)在STC组中相对丰度减少。结论 STC组与对照组人群肠道在菌群物种种类丰富度上差异存在统计学意义,而在菌群分布均一性上差异无统计学意义;在菌属水平,两组人群的粪便菌群构成也存在较大差异。     

低龄儿童龋病牙菌斑的菌群结构分析

目的通过低龄龋齿儿童与口腔健康儿童的微生物组检测,探讨低龄儿童龋病牙菌斑的菌群组成特征。方法在深圳地区招募轻度龋齿、重度龋齿及口腔健康儿童共100名,采集其牙菌斑或健康牙齿表面微生物样本,采用MiSeq测序平台进行16S V4-V5区域的高通量测序。同时,通过生物信息分析方法,对低龄龋齿儿童的牙菌斑的微生物组成的特征进行挖掘分析。结果相对口腔健康儿童,重度龋齿患儿的牙菌斑微生物多样性增加,轻度龋齿患儿则减少,但变化不显著。门水平的优势菌主要为放线菌门、变形菌门及拟杆菌门,虽有相对丰度变化但差异无统计学意义。前10位的优势菌属中,轻度及重度龋齿儿童的最高丰度优势菌属为棒状杆菌属,重度龋齿儿童与健康儿童中的棒状杆菌丰度差异有统计学意义(t=-2.195 5, P=0.028 1)。健康儿童口腔的优势菌属包含了卟啉单胞菌属,但在轻度及重度龋齿儿童的优势菌属则替换为月形单胞菌属。种水平的菌群结构分析显示,前10位的优势菌丰度变化差异无统计学意义,而低丰度的致病菌如变异链球菌(H=27.302 1, P<0.000 1)、Atopobium parvulum(H=17.418 2, P=0.000 2)、栖牙普氏菌(H=10.598 9, P=0.005 0)、唾液普氏菌(H=10.035 0, P=0.006 6)等则在重度龋齿儿童中显著富集。结论低龄龋齿儿童的牙菌斑微生物结构发生了改变,部分口腔有害菌的丰度显著增加与龋病严重程度密切相关。     

五指山猪和长白猪背最长肌差异基因的筛选与注释

为了筛选五指山猪和长白猪背最长肌组织差异表达基因,本研究采用RNA-seq技术和生物信息学方法对6月龄、8月龄五指山猪和长白猪的背最长肌进行转录组测序分析,并对差异表达基因进行GO和KEGG Pathway显著性富集分析。通过与猪基因组比对分析后发现,在6月龄和8月龄五指山猪和长白猪均有约44 000 000条Clean reads能够比对到猪基因组上相关基因,每个文库均获得约18 200个表达基因,而转录本的数据为25 000个。在6月龄五指山猪与长白猪中共有30个基因差异表达,在8月龄五指山猪与长白猪中获得29个差异表达的基因。这些差异表达的基因主要富集在与糖酵解代谢、MAPK信号代谢通路和胰岛素信号通路等肌肉发育信号通路,通过筛选获得了与肌肉生长发育有关的候选基因,为探索五指山猪肌肉发育的分子机制提供了理论依据。     

基于重测序信息的金针菇菌株资源遗传多样性及群体结构分析

通过对来自国内外的28份金针菇菌株资源的重测序共计检测到SNP位点1 241 583个,InDel位点623 670个。通过筛选分型,1 474个高质量SNP标记（多态信息含量指数PIC介于0.101-0.966之间）被用于金针菇资源群体多样性和结构分析。经计算,菌株间遗传距离在0.057-0.631之间。UPGMA进化树拓扑结构显示栽培菌株是其与野生菌株混合分支的一个亚支,自然栽培和工厂化栽培菌株可各自聚成一支,符合金针菇育种历史。群体结构结果显示金针菇种质资源包含5个亚群。主成分分析显示菌株在二主分之间的位置及互相间距离基本符合进化树分类、群体结构和遗传距离。本研究为金针菇分子标记和基因型的确定提供序列基础,也为后续资源保护利用、重要农艺性状的基因定位和基于分子标记的聚合育种提供理论依据。     

未培养真菌分离培养方法初探

据估计自然界中真菌有220万到380万种,目前已经描述的真菌仅约12万种,不超过总数的8%。大量基于高通量测序的研究显示,自然环境中蕴藏的真菌多样性可能远远超出我们的预估。然而基于传统的分离培养技术的研究中,大量真菌却因难以获得纯培养而未被认知。因此探索新的真菌分离技术有助于提高我们对自然界中真菌多样性的认识,并获得可供开发利用的全新生物遗传资源。本研究以淡水湖底泥为调查对象,从优化培养条件和原位培养两个方面探索未培养真菌的分离培养方法,并与传统培养方法及免培养的高通量测序结果比较,评估各方法的分离效果。结果显示,低温分离显著影响获得的真菌组成,有利于嗜冷真菌的获得;无论在4℃低温还是25℃常温条件下,在培养基中添加维生素都能显著提高分离获得的真菌多样性,在属级水平上提高比例分别高达207%和81%。相较于传统25℃稀释平板法,基于分离芯片技术的原位培养在分离纯化效率、未知真菌捕获率以及物种多样性和均匀度等方面具有显著优势,显示原位培养技术在未来真菌分离培养中可能具有极大应用前景。     

基于Miseq测序技术分析黄颡鱼不同养殖模式下池塘微生物群落结构多样性

利用Miseq测序技术分析了黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco (Richardson)三种养殖模式[(黄颡鱼单养、黄颡鱼混养草鱼(Ctenopharyngodon idellus, Valenciennes)和黄颡鱼混养草鱼、鳙(Aristichthys nobilis, Richardson)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix, Valenciennes)]下养殖水体及底泥微生物群落结构多样性。结果显示, 12个样本共获得了655100条合格16S rDNA序列, 每个样本获得的有效序列数目为41256—77508, 可归纳为608—3686个分类操作单元。α多样性指数结果表明, 在三种养殖模式下末期水体的微生物群落丰度和多样性均高于养殖初期, 黄颡鱼混养草鱼模式下水体的群落丰度最高(Chao1指数: 2199.25, ACE指数: 2374.60), 黄颡鱼混养草鱼、鲢、鳙模式下水体微生物群落多样性最高(Shannon指数: 4.88, Simpson指数: 0.021)。样本聚类分析及PcoA主坐标分析结果表明, 黄颡鱼单养及黄颡鱼、草鱼混养模式下的水体和底泥的菌群组成及群落结构相似性较高, 黄颡鱼、草鱼、鲢、鳙混养模式下样本单独形成一类。从门水平的比较分析发现, 所有样本检测到细菌有8门, 其中变形菌门(Proteobacteria)的物种丰度在所有样本中占绝对优势地位。放线菌门(Actinobacteria)在养殖末期升高成为水体中占比第二的优势门, 尤其是黄颡鱼混养草鱼模式下(37.6%)。黄颡鱼在单养模式下, 养殖末期水体拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌含量均明显增加(1.95%到10.98%)。从属水平的比较分析发现, 各样本之间的优势属组成有较大差异, 其中黄颡鱼在单养模式下水体样本中气单胞菌属(Aeromonas)在养殖末期丰度占优势(5.81%)。从微生物群落结构和多样性的角度考虑, 黄颡鱼、草鱼、鲢、鳙混养是一种值得推荐的养殖模式。