促髓细胞分化的锌指基因单向PCR扩增直接测序的研究

锌指基因是一种造血调节基因,编码锌指结构蛋白,主要在髓细胞中表达,促进髓细胞分化,在急性早幼粒白血病维甲酸治疗中,促使病情缓解。本文报道了我们从基因分子上研究锌指基因作用中,探索并建立了单向聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增特定单链ＤＮＡ,直接测序的新方法。它能产生质和量均佳的单链ＤＮＡ,无需纯化即可直接用于测序,使复杂的测序研究简便易行,可在２,３天内完成。这种单向ＰＣＲ扩增特定单链ＤＮＡ直接测序的方法,经对锌指基因的ｃＤＮＡ测序,得到验证。此法不仅适用于疾病研究中的ＤＮＡ测序,还可制各单链ＤＮＡ探针,更利于基因结构组成的研究。     

脑室注射6-OHDA对黄鼠脑内单胺类神经递质与β-内啡肽和血清TSH含量影响

本文研究了脑室注射6—OHDA对达乌尔黄鼠脑内单胺类递质和β内啡肽,血清TSH,T3和T4含量的影响:1)注射后7天内,单胺类含量随剂量和注射后的天数而改变。2)下丘脑,丘脑,垂体和海马β内啡肽含量在注射后第3天显著升高,第5天,第7天逐渐回降,但仍高于对照。3)血清TSH,T3,T4含量在注射后3—5天内显著低于对照。4)冬眠动物垂体,下丘脑和海马β内啡肽含量比对照显著增高。本文为脑室注射6—OHDA促进黄鼠冬眠的生理学机制提供了一些依据。     

海枣曲霉β-木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中。通过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双水相分离．相继用SephadexG-100凝胶过滤、DEAE—Sephadex A-50离子交换柱层析、羟基磷灰石吸附层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、SE—Sephadex C-50离子交换层析以及Sephadex G-50柱层析等提纯步骤,提纯到凝胶电泳均一的β-木糖苷酶。该酶的最适pH为3．5,最适温度为65 C．在pH3．5—6．5之间稳定,酶保温30分钟时的半失活温度(t1-2)为68C。酶的分子量勾95 000,等电点为4．4。Hg2-和Ag+对该酶有强烈的抑制作用。在所测定的底物中．Β-术糖苷酶仅对β-木精苷(pNP-β-Xyl)有强水解作用。其Km值为0．63mmol／L．Vmax为410 umol·min 1．Mg-1。D-木糖为β-木糖苷酶的竞争性抑制剂,其K．值为7．5mmol／L。     

湖羊瘤胃微生物GH9家族葡聚糖酶基因IDSGLUC9-25的表达与功能表征

【目的】葡聚糖酶是饲用添加剂的重要成分,本研究旨在从湖羊消化道微生物中挖掘性质优良的GH9家族葡聚糖酶基因,用于研发新型饲用酶制剂。【方法】从湖羊瘤胃微生物cDNA中扩增IDSGLUC9-25基因,在大肠杆菌中进行异源表达,对重组蛋白进行诱导表达和纯化,研究重组蛋白的酶学性质和底物水解模式。【结果】IDSGLUC9-25基因编码527个氨基酸,包含一个CelD_N结构和一个GH9家族催化结构域;重组蛋白rIDSGLUC9-25分子量约为62.7 kDa,最适反应温度和pH分别为40℃和6.0,在30-50℃下活性较高,在pH 4.0-8.0范围内能够保持较高的稳定性,经pH 4.0-8.0缓冲液处理1 h后残余活性均大于90%;底物谱分析表明,rIDSGLUC9-25能催化大麦β-葡聚糖、苔藓地衣多糖、魔芋胶和木葡聚糖,比活性分别为(443.55±24.48)、(65.56±5.98)、(122.37±2.85)和(159.16±7.73) U/mg;利用薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析水解产物发现,rIDSGLUC9-25降解大麦葡聚糖主要生成纤维三糖(占总还原糖64.19%±1.19%)和纤维四糖(占总还原糖26.24%±0.12%),催化地衣多糖主要生成纤维三糖(占总还原糖78.46%±0.89%)。【结论】本研究报道了一种来自密螺旋体属细菌的内切β-1,4-葡聚糖酶IDSGLUC9-25 (EC 3.2.1.4),能高效催化多糖底物生成纤维三糖和纤维四糖,为研发饲用酶制剂和制备低聚寡糖建立基础。     

大鼠肝癌中α_2-巨球蛋白等几种分泌性蛋白基因表达的变化

用Northern blot方法对二乙基亚硝胺所诱发的大鼠肝癌中内源性蛋白酶抑制因子α_2-巨球蛋白(α_2-M)、非特异性免疫抑制剂α_1-酸性糖蛋白(α_1-AGP)及雄性激素正调控的α-2u球蛋白(α-2u)三种分泌性蛋白基因表达情况进行了分析。结果表明在大部分(14/16)肝癌样品中α_2-M RNA水平显著降低;而α_1-AGP RNA水平显著高于正常对照水平;α-2u RNA水平明显下降,但在某些雄性大鼠肝癌样品中该基因却有一定程度的表达。这些结果说明,一些肿瘤宿主血浆中α_2-M水平的显著下降及α_1-AGP水平的明显升高分别是由于基因表达活性的下降及升高所致。α-2u基因表达的异常提示,在癌变过程中机体的内分泌功能发生了某些变化。     

北京鸭血清HDL主要载脂蛋白的高效液相层析分离及其理化性质

用高效液相层析(HPLC)对北京鸭血清高密度脂蛋白(HDL)的所有载脂蛋白(apo)分离纯化,得五个主要apo峰,经SDS-PAGE鉴定,均为单一带;并做了IEF、糖基含量分析;对其中含量高的四个apo峰样进行了氨基酸组成测定和N-端部分氨基酸序列分析;从所做理化性质的研究,发现北京鸭血清HDL中的主要apo为:A-Ⅰ、C-Ⅲ_o、apoC-Ⅲ_s(s=1,2)、apoC's及可能的A-Ⅲ,几乎不含E和A-Ⅱ_o北京鸭HDL中apo的上述组成特点明显不同于易患动脉粥样硬化(As)的人及兔等动物,在一定程度上决定了北京鸭HDL的形成与代谢具有其特点,该特点与北京鸭不易形成As密切相关。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

气相色谱法检测水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜残留量

目的 建立测定水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)残留量的气相色谱法,并进行方法学的验证和初步应用。方法 采用气相色谱法检测,对色谱柱、柱温、分流比以及供试品预处理方法进行了优化,并对优化后的方法进行系统适用性和专属性、线性和范围、准确度和精密度、定量限和检测限、耐用性的方法学验证。结果 色谱柱使用DB-624(30 m×0.53 mm, 3.00μm)毛细管柱,以氮气为载气,进样口温度设定为250℃,FID检测器温度设定为270℃,柱温为120℃,分流比为5∶1。供试品在检测前采用乙腈沉淀蛋白的预处理方式(体积比1∶9～1∶19)以去除其中的干扰杂质。方法学验证结果显示,系统适用性和专属性良好,DMSO色谱峰与杂质分离良好,在50～1 000μg/mL范围内线性关系良好(R²=0.999 9)。检测限为20μg/mL,定量限为50μg/mL;准确度结果均在90%～110%之间,精密度的RSD均<10%。水痘减毒活疫苗原液中的DMSO残留量均未检出。结论 建立的气相色谱法能稳定、准确、快速地检测水痘减毒活疫苗原液...     

miR-328-3p-Akt/mTOR轴在雷公藤甲素抑制脑胶质瘤细胞生长中的作用及机制研究

目的 以U251细胞和原位胶质瘤小鼠模型为研究对象,观察miR-328-3p对脑胶质瘤细胞生长和凋亡的影响,探讨miR-328-3p-Akt/mTOR轴在雷公藤甲素抑制脑胶质瘤细胞生长中的作用及机制。方法 在U251细胞中过表达miR-328-3p,再结合雷公藤甲素的处理,采用qRT-PCR、CCK8、克隆形成实验、流式细胞术、Western Blot等方法检测miR-328-3p在雷公藤甲素抑制脑胶质瘤细胞U251生长中的作用;构建miR-328-3p稳定过表达的原位胶质瘤小鼠模型,采用qRT-PCR和小动物活体成像体内验证miR-328-3p在雷公藤甲素抑制脑胶质瘤细胞生长的作用。结果 miR-328-3p在脑胶质瘤细胞和组织中表达降低,其表达水平与原发性和复发性脑胶质瘤患者总生存率呈正相关;miR-328-3p与雷公藤甲素可以协同作用抑制脑胶质瘤细胞的生长,促进脑胶质瘤细胞的凋亡,抑制Akt/mTOR信号通路的激活。结论 miR-328-3p在脑胶质瘤细胞中起到抑癌基因的作用,雷公藤甲素可能通过miR-328-3p促进脑胶质瘤细胞凋亡,抑制Akt/mTOR信号通路的激活,进而抑制...