蛋白质内含子介导的蛋白纯化系统在变性条件下的应用

由蛋白质内含子介导的亲和蛋白质纯化系统(IMPACT)已得到广泛应用,通过其纯化得到的目的蛋白不含蛋白纯化标签以及多余的氨基酸残基,且操作简单成本低廉。这些优点使得其相对于其他蛋白纯化系统有着无与伦比的优势。但是现有报道都局限于非变性条件下使用,这往往会限制其在一些包涵体蛋白变性条件下使用。以一已知表达形成包涵体形式的丝素蛋白为例,研究IMPACT系统在时变性条件下使用变性剂浓度、温度和诱导断裂还原剂浓度。实验表明,在4 M尿素,100 mM DTT室温作用下蛋白质内含子会获得最大断裂效率(80%)。柱上在线断裂实验表明,其最终蛋白得率超过65%。     

AUT凝胶电泳在牛胰核糖核酸酶折叠研究中的应用

目的:牛胰核糖核酸酶是一种用于蛋白折叠研究的经典模式蛋白,在折叠研究过程中主要使用高效液相色谱用于分离检测不同阶段的蛋白折叠中间体。高效液相色谱具有自动化、分离效果好、样品可回收等优点,同时也存在检测通量较低、仪器设备较为昂贵等不足。AUT凝胶电泳简便、快捷、检测通量较高,本文尝试将其应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。方法:使用AUT凝胶电泳、酶活性检测、质谱对牛胰核糖核酸酶还原变性过程及产生的折叠中间体进行检测;通过高效液相色谱和质谱对折叠中间单体进行分离检测,并分别进行AUT凝胶电泳检测以解析各折叠中间单体在电泳中的条带位置;通过AUT凝胶电泳和酶切后质谱鉴定各折叠中间单体的二硫键配对方式。结果:AUT凝胶电泳可以有效区分不同条件下的牛胰核糖核酸酶还原变性过程,检测结果与酶活性、质谱结果相符,并可以很好地区分牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体。高效液相色谱将牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体分离为13个色谱峰,并与AUT凝胶电泳中的11个条带位置进行匹配。确认牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间单体的二硫键配对方式,并与AUT凝胶电泳条带进行匹配,Cys58-Cys110和Cys26-Cys84构象熵减作用强于Cys40-Cys95和Cys65-Cys72。结论:AUT凝胶电泳适用于检测牛胰核糖核酸酶折叠中间体,可以与高效液相色谱、质谱等检测技术相互补充,共同应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。     

用于分析土壤微生物结构变化规律的变性梯度凝胶电泳条件研究

研究确定土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为进一步研究分析土壤中微生物结构变化规律提供理论依据。土壤微生物基因组DNA提取采用直接法和间接法进行比较; PCR扩增条件调整扩增体系、DGGE电泳条件调整变性剂范围,并对其结果进行比较分析。通过对DGGE电泳相关条件的研究,结果显示,土壤中粗基因组DNA采用直接法提取,然后进行纯化; PCR扩增体系中加入BSA,DGGE电泳系统组成中变性剂浓度范围为35%～55%。确定了土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为后续的相关研究提供理论依据。     

酵母乙醇脱氢酶胍变性时的失活与去折叠的比较研究

应用荧光发射光谱,圆二色光谱,二阶导数光谱和紫外差吸收光谱等监测手段,研究了酵母乙醇脱氢酶在胍溶液中的去折叠,比较不同盐酸胍浓度下酵母乙醇脱氢酶的失活与构象变化,实验表明酶的失活先于构象变化,在低浓度胍溶液中,构象尚未发生明显变化时,酶活几乎已经完全丧失,由上述结果可见,含有辅基金属离子Ｚｎ＾２＋酶的活性部位较酶分子的整体结构也具有柔性。     

λ-DNA Hind Ⅲ 经酸变性-复性形成变异形态

对λ噬菌体ＤＮＡ Ｈｉｎｄ Ⅲ 依次进行了酸变性、复性、ＤＮａｓｅ Ⅰ降解处理。处理后的混合物的柱层析色谱显示出一个抗ＤＮａｓｅ Ⅰ酶切的产物的微弱吸收峰。原子力显微术（ＡＦＭ）研究的结果表明,该产物是一种变异形态的ＤＮＡ,其长度介于对应的双螺旋ＤＮＡ的Ａ构象长度和Ｂ构象长度之间,高度（平均６．８１ｎｍ）则为双螺旋ＤＮＡ的测量高度的１３倍,分析和对照实验均说明该变异形态ＤＮＡ不是超螺旋结构,因而极     

卵清溶菌酶及其定点突变体热力学稳定性研究

测定了野生型卵清溶菌酶及其定点突变体的Ｅ、Ａ３１Ｖ、Ｉ５５Ｌ、Ｓ９１Ａ、Ｄ１０１Ａ、ＳＩＳ、ＳＶＳ、ＴＩＴ、ＴＶＳ（后者三个字母为该酶序列中第４０、５５、９１位的氨基酸残基,野生型为ＴＩＳ）在不同浓度脲溶液中的变性热力学参数和酶活性,稳定性有变化 １６．８６－２８．６７ｋＪ／ｍｏｌ,变性中点脲浓度为４．８９－６．２４ｍｏｌ／Ｌ。并对这个过程的可能机理,定点突变引起的过渡热,和学参数的变化,及个别氨     

变性过程中铜锌超氧化物歧化酶的活性通道

在酶的盐酸胍变性和热变性过程中,尝试采用电荷传递反应分析方法和电子自旋共振方法考察了酶活性部位的构象变化。酶活力与构象的变化行为表明,酶的活性部位通道先于酶分子的整体构象而发生变化,它是与酶的失活同时发生的。尽管酶活性部位中的金属离子保证了酶较高的稳定性,但酶的活性部位,特别是活性通道仍然是相对脆弱的。     

菓菠萝蛋白酶的分子构象与活力变化的研究

发现CBZ-Lys·pNP能有效地被菓菠萝蛋白酶(Fruit Bromelain E.C.3.4.22.5)作用,测得Km为4.167×10~(-4)mol/L,k_(cat)为742min~(-1)。以荧光和紫外差示光谱为监测手段,对酶分子构象变化进行研究。酶的荧光强度随胍浓度增大而逐渐下降,4mol/L胍变性时,发射峰自332nm红移到353nm,并在310nm处出现新的发射峰。酶的荧光强度都因SDS存在而下降,SDS浓度大于3.47mmol/L有所回升,并出现红移,同时在315nm处出现新的发射肩;紫外差示光谱显示在236nm有一个较显著的员峰,此峰与β-螺旋结构变化有关,278、286和295nm出现三个负峰,260nm有较小正峰,说明酶分子中Tyr、Trp和Phe的微环境发生了明显的变化。测定酶在不同浓度胍和SDS中的变性和失活速度常数,对酶构象变化及催化活力的关系作了比较研究,酶的失活速度均大于变性速度。     

胍和脲溶液对氨基酰化酶活性和构象的影响

 本文研究了不同浓度盐酸胍和脲溶液对猪肾氨基酰化酶活性和构象的影响。研究结果表明,在低浓度的胍和脲溶液中(小于2mol/L),酶分子的整体构象变化的程度与活力变化的程度基本是平行的;而在高浓度的胍和脲溶液中(2mol/L以上),失活程度稍大于构象变化的程度。这些结果与分子量和亚基组成基本相同,但不含金属配基的肌酸激酶的结果,以及小分子量的胰凝乳蛋白酶和牛胰核糖核酸酶的结果相比较来看,可以认为配基锌离子的存在对酶分子的活性部位区域构象的稳定作用有一定的贡献,致使氨基酰化酶的活性部位的构象状态不象后三种酶那样脆弱。同时,我们还发现锌离子的存在对酶分子整体构象的稳定性上贡献很小。