异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点的研究

pDVWS501为含有登革2型病毒全长cDNA的质粒, 可利用感染性转录体技术恢复为有活力的病毒MON501. 将MON501注射乳鼠脑内可引发脑炎症状, 其E蛋白的62, 203位分别为Glu, Asn. 采用OL-PCR方法把pDVWS501 E62位氨基酸突变为Lys, 得到质粒TB62; E203位氨基酸突变为Asp, 得到质粒TB203. 将pDVWS501, TB62和TB203酶切后体外转录得到全长登革2型病毒转录体, 应用电穿孔技术转染BHK-21细胞, 7天后收毒. RT-PCR证实有登革2型病毒存在, 接种C6/36细胞, 3~5 d可使其产生典型病变. 测定突变区域的序列, 结果表明得到了恢复病毒MON501和E62, E203位点突变的重组病毒HFT62, HFT203. 3株病毒均在其基因组5′端加“G”, 3′端则与登革2型病毒野生株相同. 分别将3株病毒稀释至10⁵~ 10² TCID₅₀, 经脑内途径注射1日龄乳鼠, 发现与MON501相比, HFT62, HFT203在同一稀释度发病乳鼠的个数减少, 发病时间延长且差异显著, 表明E62, E203可能是登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点.     

影响棉铃虫增殖马尾松毛虫质型多角体病毒的条件因子的初步探讨

棉铃虫为马尾松毛虫多角体病毒 (DPCPV)理想的替代寄主。试验结果表明 ,不同接毒方法、接种浓度、接种温度及接种虫龄对棉铃虫增殖病毒有影响 ,以病毒涂在人工饲料表面的接毒方法、2 0～ 2 3℃温度及 3龄虫为最佳组合条件。由于利用棉铃虫生产出的病毒 (Ha DPCPV)容易诱发棉铃虫本身的多角体病毒 (NPV) ,尤其对那些带有NPV源的虫种 ,Ha DPCPV不宜作毒种 ,因此为慎重起见 ,最好用马尾松毛虫复制出的病毒作为生产毒种。     

非洲猪瘟病毒多基因家族研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病.由于ASFV基因组庞大,变异能力强,免疫逃逸机制复杂,至今无有效药物和疫苗.近年来,对多基因家族的研究取得了很大的进展,可变区多基因家族拷贝数变化是导致ASFV变异的主要原因,且陆续发现多基因家族在决定细胞宿主范围、影响病毒毒力强弱、抑制Ⅰ型干扰素信号通路、抑制干扰素抗病毒效应和促进病毒蜱源感染中具有重要作用.本文对当前的ASFV多基因家族研究进展进行总结,阐述其在基因变异和病毒感染中的作用,以期为非洲猪瘟免疫逃逸机制的探索和疫苗的研发提供理论依据.     

非洲猪瘟病毒I226R蛋白抑制cGAS-STING通路介导的天然免疫应答

本研究旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) I226R蛋白(I226R protein, pI226R)抑制cGAS-STING信号通路的作用机制。利用双荧光素酶报告系统和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)证明pI226R显著抑制cGAS-STING通路介导的I型干扰素及干扰素刺激相关基因的产生。免疫共沉淀及激光共聚焦显微镜试验发现pI226R与cGAS蛋白相互作用。免疫印迹分析证明pI226R通过自噬-溶酶体途径促进cGAS蛋白的降解。同时,pI226R阻碍了cGAS与E3泛素连接酶三基序蛋白56 (tripartite motif protein 56, TRIM56)的结合,导致cGAS的单泛素化减弱,从而抑制了cGAS的活化和cGAS-STING通路的激活。总之,本研究证明ASFV pI226R通过拮抗cGAS进而抑制宿主的抗病毒天然免疫反应,进一步增加了对研究ASFV免疫逃逸机制的理解,为疫苗的研发提供了理论基础。     

去N端信号肽的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的原核可溶性表达及其免疫原性评价

水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,gE)是VZV亚单位疫苗的主要候选蛋白,但目前原核表达系统制备的gE蛋白以包涵体形式为主,可溶性差。本研究采用去除第1～30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因,将其与原核表达载体pET32a连接,并转化至感受态细胞BL21(DE3)中。使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,His-tag柱纯化重组gE蛋白,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其特异性。用该重组gE蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法检测多克隆抗体效价及特异性。结果显示,BL21/pET32a-VZV gE工程菌可以表达可溶性重组gE蛋白,纯化后纯度约为90%。WB鉴定该重组蛋白具有良好的免疫反应性。ELISA检测显示小鼠抗VZV gE多克隆抗体效价＞1∶10 000,间接免疫荧光实验结果显示该抗体特异性较高。结果表明,本研究在原核表达系统中成功表达可溶性重组VZV gE蛋白,同时该蛋白具有较强的免疫原性,这为VZV gE亚单位疫苗的研制和大规模生产奠定了基础。     

HIV-1基因表达的转录调控

高效抗逆转录病毒治疗（HAART）可以有效地抑制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）的复制及血浆病毒载量,延缓发病进程,改善、提高患者的生活质量和存活时间。但是,一旦停止治疗就会导致血浆病毒血症迅速反弹,HIV-1以原病毒的形式在静息记忆CD4⁺T等细胞中的持续存在是清除HIV-1的一个障碍。HIV-1基因转录的激活与阻抑决定了受感染细胞进入产毒性感染或潜伏感染。本文从原病毒整合位置与转录干扰、细胞转录因子与HIV-1启动子相互作用招募RNA聚合酶起始转录、转录的表观遗传调控和反式激活因子Tat及其相关蛋白促进转录延伸等方面探讨了HIV-1原病毒转录调控机制。     

寄生蜂携带的多DNA病毒的起源及其特性

病毒在通常意义上都是有害的寄生生物,但是有一类特殊的多DNA病毒(PDV)却成为在数量庞大的寄生蜂的生活史中不可或缺的共生病毒.PDV随着寄生蜂的卵一起被注入到寄主的体内,调控寄主的免疫和发育生理,从而确保幼蜂在寄主体内生存发育.PDV的基因组整合在寄生蜂的基因组内,因此PDV病毒粒子的形成并非在寄主受到侵染的组织内,而是位于寄生蜂卵巢的特定细胞(卵萼细胞)中,其编码的蛋白质几乎没有病毒结构性蛋白,主要的表达产物都用于调控寄主的生理活动.PDV基因编码序列比对分析结果显示,茧蜂病毒(BV)与致病性的裸病毒nudivirus和杆状病毒baculovirus存在一定的亲缘关系,然而这些同源基因已高度分化,具有不同的生物学特性,同时也不能确定这些基因是否还具有原始的功能.在寄生蜂基因组中尚有许多与裸病毒和杆状病毒类似的基因,其中一部分基因能够编码BV病毒粒子的结构蛋白,其表达模式亦与PDV病毒粒子的形成有关.由于PDV使用了与这2种病毒类似的传播途径,才使得寄生蜂的PDV基因转入寄主体内发挥作用,虽然这不能说明PDV属于这2种病毒,至少存在PDV从这2种病毒发展而来的可能性.     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。