利用短短小芽孢杆菌启动子和信号肽编码序列构建穿梭分泌表达载体

以短短小芽孢杆菌B15的总DNA为模板,利用PCR技术克隆到其细胞壁蛋白基因串联启动子和信号肽编码序列,测序分析后提交GenBank,登录号为AY956423。重新设计引物扩增该片段并在PCR产物两侧引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点,将PCR产物双酶切后克隆至穿梭载体pP43NMK的相应位点构建分泌表达载体pP15MK,插入片段置于该载体中mpd基因的上游,并使信号肽编码序列与去除了自身信号肽编码序列的mpd基因阅读框恰好融合。将pP15MK导入枯草杆菌构建表达菌株1A751(pP15MK),在短短小芽孢杆菌启动子和信号肽元件的带动下,mpd基因能够在表达菌株的对数生长期和稳定期持续性高效分泌表达,表达产物结合在细胞膜上;发酵液在48h酶活达到最高值7.79U/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的8.1倍。     

海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987菌株抑制病原真菌机理

[目的]探讨海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987菌株的代谢产物BMME-1,对植物病原真菌茄链格孢菌的抑菌作用机理.[方法]分别使用分光光法、气相色谱-质谱GC-MS联用技术、红外光谱法等,检测了BMME-1处理病原真菌后,菌体渗透性、细胞壁及细胞膜成份的变化.[结果]BMME-1对茄链格孢菌的抑菌中浓度(MIC_(50))为6.2 mg/L,最小杀菌浓度(MFC)为50 mg/L,在MIC_(50)浓度或高于此浓度处理靶标菌,将导致菌体蛋白质、核酸等大分子物质的外流;处理菌株葡聚糖结构β-型糖苷键、碳-氧键(C-O)、碳-氢键(C-H)等基团的特征吸收强度降低,-OH、C=O的伸缩振动吸收强度升高;菌体细胞壁几丁质结构中酰胺I键吸收强度发生变化;与对照菌株的麦角甾醇含量(62.52±3.31%)相比,处理菌株麦角甾醇减少为(56.36±2.52)%,同时出现麦角固醇合成中间产物粪甾醇.[结论]BMME-1对病原真菌的抑制表现为:干扰细胞膜麦角甾醇的合成从而改变了细胞的通透性;对细胞壁葡聚糖结构的影响较大而几丁质次之.     

利用Inverse PCR快速筛选单个T-DNA拷贝转基因水稻植株的方法

为了获得单个T-DNA插入拷贝的植株, 我们建立了一套利用Inverse PCR(IPCR)快速检测转基因水稻中T-DNA拷贝数的方法。用IPCR的方法可以扩增出与已知T-DNA序列相邻的水稻基因组DNA未知序列,由此推测转基因水稻植株中T-DNA的拷贝数。我们共对15个转化株系20棵不同植株的DNA进行了IPCR检测。其中12株表现为T-DNA单拷贝插入,3株为双拷贝插入,1株为三拷贝插入。另外4株未检测到T-DNA插入拷贝。IPCR分析结果经过Southern杂交和测序的验证。     

猴头菌粉与5-氨基水杨酸联用抑制小鼠急性溃疡性结肠炎并提高肠道共生菌Parabacteroides distasonis丰度

猴头菌Hericium erinaceus是一种药食同源真菌,广泛应用于治疗胃肠道疾病,可采用液态发酵技术规模化量产获得菌丝体粉。本研究旨在分析猴头发酵菌粉（HE,300mg/kg/d）与5-氨基水杨酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA,150mg/kg/d）联用对葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎的治疗作用。HE和5-ASA能够减轻小鼠急性溃疡性结肠炎症状,包括减轻体重的降低率和疾病活动指数评分（DAI）。HE和5-ASA联用可以显著抑制小鼠结肠组织炎症,通过降低肿瘤坏死因子-α（Tnf-α）和白细胞介素-β（Il-β）基因的表达。此外,利用16S rRNA基因测序技术对小鼠盲肠微生物群落组成及结构进行分析。HE与5-ASA联用可以重塑肠道微生态环境,并显著提高狄氏副拟杆菌Parabacteroides distasonis相对丰度。人体粪便体外发酵结果证实HE与5-ASA可以增加P. distasonis。综上,HE与5-ASA联用可有效抑制小鼠结肠炎症水平,并调节肠道微生物,可能是通过增加P. distasonis起作用。     

盐生盐杆菌在光生物制氢研究中的应用

回顾了近30年来盐生盐杆菌（Halobacterium halobium）在光生物制氢中的应用。就H.halobium可能的光合产氢机理、产氢研究现状及产氢工艺进行概述。分析了盐生盐杆菌光照产氢的主要影响因素,提出未来利用H．halobium生物制氢的研究方向。     

提高农杆菌转化水稻频率的研究

以16种重要的籼稻和粳稻栽培品种为材料,研究了影响农杆菌转化水稻频率的有关因素,结果表明,CC培养基是绝大多数水稻全国组织的最适诱导与继代培养基;添加2．5－5mg/L ABA可以有效地改善水稻愈伤组织的质量,籼稻愈伤组织所需的筛选剂浓度低于粳稻愈伤组织所需的浓度,根癌农杆菌EHA105菌株对水稻的转化效果优于LBA4404和AGL1菌株的效果,头孢霉素对农杆菌的抑制效果优于羧苄青霉素的效果,共培养后进行适当的干燥处理既可增强脱菌效果,又可提高转化频率,应用我们所优化的农杆菌转化技术体系,获得了10个品种的水稻转基因植株。     

长期住院老年患者感染的鲍曼不动杆菌耐药性分析

为了解复旦大学附属华东医院长期住院老年患者感染的鲍曼不动杆菌的耐药性特征,本研究收集了2011年9月~2012年8月临床分离自老年病区长期住院患者的52株鲍曼不动杆菌,分析菌株的耐药性、产酶类型、生物膜形成能力及耐药基因的携带情况。结果显示,菌株主要分布在呼吸重症监护室,分离的标本以痰标本为主,占86.54%。52株鲍曼不动杆菌中,多重耐药菌株最高,占76.92%。对头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低,为30.77%,对其余抗菌药物耐药率均在50%以上。产酶阳性率为82.69%,其中产其他水解酶的菌株最多,占63.46%。生物膜形成的检出率为5.77%。6株广泛耐药菌株共检出9种耐药基因。结果提示,从老年病区长期住院患者分离的鲍曼不动杆菌耐药现状严重。因此,医院感染控制应以呼吸重症监护室为重点,同时加强对生物膜阳性菌株所分布病区的耐药性监测和消毒隔离,以预防和控制耐药菌的产生和传播。     

鲍曼不动杆菌临床分布、耐药性分析和肺部感染病例的预后研究

目的了解浙江大学医学院附属第一医院临床分离鲍曼不动杆菌的分布情况、耐药状况以及肺部感染病例的临床预后,为临床鲍曼不动杆菌感染的治疗提供参考。方法分析该院2013年1月至2013年6月培养到的非重复鲍曼不动杆菌420株的临床分布和耐药性,回顾性分析鲍曼不动杆菌肺炎并接受头孢哌酮/舒巴坦治疗患者的临床资料。结果 420株鲍曼不动杆菌来源以重症监护室（ICU）为主,占45.96%。其次为外科（神经外科、肝胆外科）,占36.19%。标本构成中以呼吸道标本最高（66.90%）,其次为血培养（8.81%）。共有79例（18.8%）患者≥2个部位分离到鲍曼不动杆菌,其中62例（78.5%）呼吸道是首发的分离部位、之后出现第二个部位培养阳性。体外药敏显示,鲍曼不动杆菌对阿米卡星、替加环素、左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为5.2%、15.9%、35.6%、64.2%、71.1%、79.1%和88.9%。选取其中诊断为肺炎患者72例。72例患者粗死亡14例（19.4%）。患者病情好转组治疗初C反应蛋白平均水平为69.5 mg/L、死亡组为137.6 mg/L,经比较差异有统计学意义（P〈0.05）;患者病情好转组治疗初APACHE II为16.4、死亡组为19.7,经比较两组差异有统计学意义（P〈0.05）。结论入住重症监护室、外科手术后患者是鲍曼不动杆菌分离的主要人群,18.8%的患者在多个部位培养到鲍曼不动杆菌,鲍曼不动杆菌耐药率高,抗菌药物选择困难。治疗初期C反应蛋白和APACHE II水平对预后有参考价值。     

Bt群体信号应答因子nprR基因的缺失对cry1Ac基因表达的影响

摘要：【目的】研究群体信号应答蛋白编码基因nprR在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）HD-73菌株晶体蛋白形成过程中的作用。【方法】通过同源重组,构建了HD-73 nprR基因缺失突变菌株HD73（ΔnprR ）。利用启动子-lacZ融合、SDS-PAGE方法,测定不同培养基中nprR基因转录活性及nprR基因缺失对cry1Ac转录及表达的影响。【结果】启动子转录活性分析表明,在LB和SSM培养基中nprR基因从对数期结束（T0）开始表达,稳定期持续表达。在LB培养基中,nprR基因的缺失使cry1Ac基因在生长过渡期和稳定期前期转录活性显著提高,同时HD73（ΔnprR ）菌株Cry蛋白生成量也明显高于出发菌株HD-73,但是在芽胞形成释放后,Cry蛋白的表达没有明显的区别。【结论】在丰富培养基中苏云金芽胞杆菌nprR基因的缺失在生长过渡期和稳定期前期能够提高cry1Ac基因转录和表达,从而缩短了cry基因表达时间,并且Cry蛋白总产量与出发菌株相当。     

响应面法优化类芽胞杆菌HB172198产褐藻胶裂解酶发酵培养基

为了提高类芽胞杆菌新种HB172198产褐藻胶裂解酶活力,本研究采用响应面法对该菌株液体发酵培养基进行了优化实验。在单因素实验和Plackett-Burman试验筛选出海藻酸钠、胰蛋白胨、NaCl、MgSO4·7H2O等4个显著影响产酶因素的基础上,通过Box-Behnken设计及响应面法进行回归分析,得出产褐藻胶裂解酶最佳发酵培养基,其成分为:海藻酸钠7.50 g/L、胰蛋白胨13.57 g/L、NaCl 29.75 g/L、MgSO4·7H2O 0.08 g/L。优化条件下该菌株最大酶活性达14.60 U/mL,是优化前的1.87倍。本研究为菌株HB172198产褐藻胶裂解酶的大规模生产和工业应用提供了重要的理论依据。