甲基对硫磷水解酶基因的高效表达及酶活性分析

假单胞菌WBC 3的甲基对硫磷水解酶基因mph在大肠杆菌系统AD494(DE3) pET32a ( + )中实现了高效可溶性融合表达。表达的重组酶能够有效地被亲合层析纯化。酶学性质分析表明 ,重组酶对底物乙基对硫磷水解能力较野生酶相比有近 4倍的提高 ,对甲基对硫磷和杀螟松的水解活力无明显变化。以融合蛋白形式存在的重组酶在室温及 4℃下的贮存稳定性明显优于野生型酶。     

植物蔗糖转运蛋白表达的调控因素与分子机制

植物光合作用的产物主要以蔗糖的形式在植物体内进行从源到库的运输.蔗糖转运蛋白是此过程的重要参与者,其表达和调控与植物中光合作用产物的分配紧密关联,从而调控着植物的生长发育、结果结实、抗逆抗病等性状.蔗糖转运蛋白的表达受到植物发育时期、外界环境条件及激素的影响.蔗糖转运蛋白的调控机制有转录因子的调节、基因内部序列调控、蛋...     

振动训练与心血管及脑部疾病防治研究进展

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)及脑部疾病已成为全球范围内主要疾病致死原因和重大公共卫生问题,振动训练可作为心血管及脑部疾病的有效干预手段,其主要通过调节人体血压与心率、血管阻力与血流量、神经结构与功能,改善代谢综合征、心血管及脑部疾病患者心功能和认知及运动功能,延缓疾病发展进程;其机...     

草木樨状黄芪变异系中甲硫氨酸代谢相关cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用mRNA差异显示技术(differential display)从草木樨状黄芪耐甲硫氨酸变异系中分离到一差异cDNA片段,命名为tm03(360bp)。mRNA杂交结果显示,该片段只在变异苗中表达,初步确定其与甲硫氨酸代谢相关。测序后在Genebank搜寻,未发现有同源序列。进一步分析表明,该cDNA克隆可编码完整的蛋白。在该基因片段两端分别合成含HindⅡ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到pRSET A表达载体,转化宿主菌JMl09(DE3),经IPTG诱导表达了N′端含6个组氨酸的蛋白质,分子量约为14kD,为进一步研究该蛋白的结构和生物学功能奠定基础。     

红细胞分化相关因子EDRF1的反义RNA下调蛋白激酶C—αmRNA的表达

为了研究通过功能筛选得到的一个新的红细胞分化相关的全长cDNA（命名为EDRF1）的功能,选择K562细胞作为模型细胞来观察反义EDRF1表达对细胞功能的影响。通过快速构建,同时得到了正向和反向插入片段的真核表达载体pcDNA3－EDRF1－S（sense）及pcDNA3－AS（antisense）,并通过改进的LipofectAMINE细胞转染和G418筛选,得到了稳定性表达的细胞株,进行基因组PCR鉴定,证明了转染的高效性。Northem Blot试验的结果表明,反义载体转染的K562细胞中,EDRF1在mRNA表达水平上受到下调,提示EDRF1反义DNA的表达可能抑制了EDRF1mRAN的正常转录。进一步,γ－珠蛋白和PKC－α的表达在反义构建质粒转染K562细胞中的表达均受到下调,这可能传递了红细胞分化的负反馈信号,从而抑制了珠蛋白的合成。     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

c—jun原癌基因及其表达产物的研究进展

c-jun原癌基因属于bZIP家族核内转录因成员之一,可以结合在许多基因的启动子上参与基因转录的调控。其蛋白编码产物能通过亮氨酸拉链形成同源二聚体或与AP-1家族其他成员形成异源二聚体,与某些基因的DNA区域特异结合以调控下游基因的转录活性。c-jun可与其他家族转录因子。如：TNF-α、PU、1、Sopl、fas、ras,C/EBP、ATF/CREB等相互作用,发挥协同效应。c-jun的调控范围十分广泛,能被各组织中的多种化学物质激活并受其影响。本文综述了近年来有关c-jun与其他转录因子相互作用及其参与各组织发生、病理变化等方面的最新研究进展。     

XBP-1转录激活系统的构建

人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB／ATF(cAMP应答元件结合蛋白／激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Westem印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-IS的活性约是空载体的3倍。成功构建了xBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBp-1在各种疾病中的作用奠定了基础。     

重组人可溶性B淋巴细胞刺激因子及其突变体的克隆、表达及活性测定

采用RT PCR方法从人外周血白细胞总RNA中钓取人可溶性B淋巴细胞刺激因子 (humansolubleBlym phocytestimulator,hsBLyS)的cDNA片段 ,再运用基因重组手段 ,利用通用型质粒pBV2 2 0构建表达载体pBV2 2 0 /hsBLyS。经测序鉴定后 ,以之为模板使用重叠PCR法扩增得到hsBLyS的两个点突变体hsBY A(Cys14 6→Ala14 6)和hsBY V (Cys14 6→Val14 6)的基因片段 ,构建表达载体 pBV2 2 0 /hsBY A及 pBV2 2 0 /hsBY V。经测序无误后 ,将上述 3种载体分别转化大肠杆菌DH5α并诱导重组蛋白质表达 ,薄层扫描结果显示 3种蛋白质在DH5α中表达量都在 2 0 %～ 30 %之间。再分别运用变性、凝胶过滤层析及复性等手段纯化目的蛋白质 ,最后通过B淋巴细胞增殖实验检测纯化产物促人B细胞增殖的活性。实验结果表明 ,3种重组蛋白质都能明显刺激人B细胞增殖 ;统计学检验显示 ,突变体rhsBY V较野生型rhsBLyS的促人B淋巴细胞增殖活性显著增强。