大豆对斜纹夜蛾幼虫抗性遗传的发展表达过程

采用植物数量性状遗传体系分离分析方法,通过4个感抗杂交组合研究了在网室人工接入斜纹夜蛾幼虫的条件下大豆抗斜纹夜蛾植株反应发育过程的遗传。不论P1、P2、F1、F2、F2：3多世代联合分析或单个分离世代分析,结果均表明大豆对斜纹夜蛾幼虫的抗性为两对主基因 多基因遗传模式。但在大豆生长发育的不同时期,随害虫数量的变化,其抗虫性遗传呈动态变化过程。在两对主基因充分表达日期,主基因的遗传率较高,达70.40%-99.21%,环境影响较小;多基因遗遗传率较低,为0.00%-22.29%。     

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

大肠杆菌热休克或冷休克启动子调控的基因表达载体

基因重组技术已经成为获得各种酶和生物活性蛋白的主要手段。虽然很多基因已在大肠杆菌中得到高效表达,但是当人们认定某种蛋白对科学研究或生产应用极为重要时,却常常因为其基因表达水平很低或产生包涵体而感到束手无策。表达载体pHsh和pEXC通过激活热休克或冷休克转录调控机制提高分子伴侣的表达水平,从而降低目标蛋白的细胞毒性并减少包涵体形成。应用于生物合成、分子修饰或生物降解的高温酶可以通过pHsh系统表达获得高产,而科研和诊疗所需要的来源于动植物和常温微生物的基因可以通过pEXC系统获得高效表达。这些新载体的发展为重组蛋白的小规模制备和大规模生产提供了新策略和有效途径。     

淀粉分支酶sbeIIb基因RNA干涉片段转化玉米自交系的研究

玉米高直链淀粉育种是玉米分子育种的一个重要研究方向.本实验中,首先研究了不同诱导愈伤培养基对再生体系的影响,确定了LS+2,4-D 2.0 mg/L+L-pro 700 mg/L+CH 500 mg/L+3 %蔗糖为诱导培养基.同时,构建并验证了含有淀粉分支酶sbeIIb基因双干涉片段载体和胚乳特异性启动子的表达载体pCAMBIA 1301+Glu+1620,并转入根癌农杆菌EHA105,以农杆菌转化法转化玉米自交系178.通过PCR检测,5株转化株表现阳性,初步证明了干涉片段已整合入玉米基因组中.     

抗菌肽VIP在毕赤酵母中的高效表达及鉴定

基于人抗菌肽VIP(Vasoactive intestinal peptide)基因序列,按照毕赤酵母密码子偏好性设计引物;用SOE-PCR法扩增目的基因;然后将目的基因克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,构建VIP分泌表达菌株GS115-p PICZαA-vip。用甲醇诱导96 h收集上清,用质谱进行鉴定,结果显示分泌表达产物与人抗菌肽VIP理论值(3 326.82 Da)完全一致,表明人抗菌肽VIP成功得到分泌表达。琼脂糖凝胶扩散法实验结果显示,重组VIP对大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923都有很强的抗菌活性,MIC(Minimal inhibitory concentration)分别为8 mmol/L和16 mmol/L。进一步细胞毒性和溶血性实验结果显示,重组VIP对正常细胞NCM460和IPEC-J2没有毒性,其对SD大鼠红细胞不具有溶血活性。通过透射电镜观察了VIP的抗菌机制,结果显示VIP主要通过破坏细胞膜的方式抑杀细菌。本研究为人抗菌肽VIP的开发应用和大量生产奠定了基础。     

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

根据已克隆的刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、SE和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化.结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05),三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后SS和bAS的表达量迅速回升,SE无显著变化.SS和bAS在叶片和根中的表达量较高,SE表达量的最大值出现在叶片和幼茎中.刺五加SS、SE和bAS基因的表达间存在显著的正相关关系(P<0.05).研究结果为进一步分析关键酶基因对刺五加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础.     

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

赤霉素受体(GID)是赤霉素信号转导途径的重要成员,直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。该研究利用同源克隆的方法,首次从紫花苜蓿中克隆得到1个赤霉素受体基因,命名为MsGID1b。序列分析发现,MsGID1b基因开放阅读框长度为1 053bp,编码350个氨基酸,推测其蛋白质分子量为39.839kD,是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。序列比对结果表明,MsGID1b基因与蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似性为98%,氨基酸序列相似性为99%,且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守结构域及GA、DELLA蛋白结合位点。荧光定量PCR分析表明,MsGID1b基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为:根盛花初花茎叶荚果;经GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗诱导后该基因表达上调,尤其是在GA3诱导下,MsGID1b基因的表达量一直维持在较高水平,表明MsGID1b基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。     

乙型脑炎病毒SA14—14—2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

壳聚糖-海藻酸钠包裹Hp全菌蛋白微球剂的研制及其表征分析

肽抗生素 (peptideantibiotics)为生物体基因编码的具有抗生素样活性的肽类物质 ,是生物体天然免疫的重要组成部分 ,分布广泛 ,目前已分离到 80 0多种。肽抗生素具有抗菌活性强、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点 ,潜在巨大的应用开发价值。为高效率制备肽抗生素 ,利用同尾酶PstⅠ和AvaⅢ能产生相同粘端的特性 ,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等多次基因操作 ,构建含 1～ 8个拷贝的人肽抗生素hPSB β基因串联体重组质粒 ,经酶切、DNA测序分析表明各串联体的DNA序列及阅读框完全正确。将各重组子转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导表达 ,Tricin…     

苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表达及其抗肿瘤活性研究

通过PCR技术,从苦瓜总DNA中扩增出编码MAP30成熟蛋白的基因,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET30a中,构建成带有N端6Histag的融合表达载体。表达载体用CaCl2介导的化学转化法转化E.coliBL21(DE3),然后利用PCR筛选阳性克隆。工程菌经1mmol/LIPTG诱导4h实现高效表达,而且在30℃时融合蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白56%。可溶性分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中主要以可溶的形式存在。重组蛋白通过Ni2+鏊合亲和层析进行纯化,纯化蛋白占上清总蛋白37.2%,发酵液产率为250mg/L。Westernblot分析表明,重组蛋白可与兔抗histag多克隆抗体发生特异性反应。利用MTT法分析重组MAP30的细胞毒性,结果表明其对小鼠3T3和S180肿瘤细胞株具有明显的抑制作用,ID50分别约为50μg/ml和30mg/ml,而对人正常胚肺二倍体WI38细胞株的毒性极小。