中国大豆疫霉菌遗传多样性的RAPD分析*

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,利用13个引物对75个中国大豆疫霉菌分离物和11个美国分离物进行PCR扩增。在78个RAPD标记中,多态性标记为68个,占87.2%。RAPD指纹聚类分析表明,当以相异距离0.3为阈值,86个分离物被划为12个RAPD遗传组,其中J组有54个分离物,占总数的62.8%,包括44个中国分离物和10个美国分离物。在中国大豆疫霉菌群体内,多数分离物之间遗传相似性较低,在DNA水平上存在显著的遗传变异,具有较丰富的遗传多样性。RAPD分组结果未表明大豆疫霉菌DNA多态性特征与病原菌毒力基因构成之间和分离物地理来源之间存在相关性,证明中国不同地区的大豆疫霉菌群体在与大豆品种的互作中发生了广泛的遗传变异,具有DNA遗传进化方向和毒力基因演变的多样性。美国大豆疫霉菌分离物间遗传距离较近,而中国分离物在总体上与美国分离物的遗传距离较远,表明中国大豆疫霉菌具有比较独特的遗传背景。     

环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO03877的原核表达

分别利用表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-1,对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzzae v.oryzae,简称Xoo)中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877进行了原核表达,并进行可溶性检测.结果显示,用pET-32a(+)栽体构建的表达质粒栽体经诱导后,重组蛋白大多位于沉淀而非上清中,经诱导条件优化后,蛋白仍以包涵体形式存在;而利用pGEX-4T-1载体表达的含有GST标签的重组蛋白为可溶性蛋白,可用于下一步纯化后进行功能分析.     

云杉腐烂病菌Cytospora piceae全基因组测序及比较基因组分析

【目的】壳囊孢属(Cytospora)真菌引起的林木腐烂病和枝枯病,是一类重要的、分布广泛的枝干病害,可引起重大经济损失和生态破坏。通过全基因组测序和比较基因组学分析,探究不同腐烂病菌的全基因组特征,分析其与寄主选择和致病性相关的基因或基因家族的差异性,将有助于进一步揭示腐烂病菌与寄主互作的分子机制,为腐烂病的有效防治提供基础资料。【方法】采用PacBio测序技术对云杉腐烂病菌Cytosporapiceae进行了全基因组测序和组装,并通过比较基因组学方法,从基因组水平探究引起腐烂病的4种腐烂病菌的基因组的差异,分析其共有的和特有的与致病相关的基因家族。【结果】C. piceae基因组大小为39.25 Mb,GC含量为51.79%。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树显示,C. piceae与Cytospora chrysosperma的进化关系相近,Valsamali和Valsapyri则更相近。比较基因组学分析表明,4种腐烂病菌均具有重复诱导的点突变(RIP)活性,其中,C. piceae的RIP活性最强。与其他3种腐烂病菌相似,与木质素降解相关的AA3和AA7家族在C. piceae中显著扩张,但木质素降解关键酶AA5家族均缺失;C. piceae和C. chrysosperma基因组中果胶降解关键酶GH28和CE8家族基因的数量与V. mali和V. pyri相近。4种腐烂病菌都含有较多数量的MFS(major facilitator superfamily)超家族转运蛋白和较少的ABC(ATP-binding cassette transporter)超家族转运蛋白,但C. piceae含有更多DHA2、PDR和MDR类转运蛋白。4种腐烂病菌的分泌蛋白的GO分类分子功能主要集中在水解酶活性,其中V. mali含有最多数量的该类别基因;而生物学过程则集中在碳水化合物代谢过程、果胶分解过程和氧化还原过程。在次生代谢核心基因中,C.piceae的PKS基因明显少于V.mali和V.pyri;在C.piceae含有的4个特异性次生代谢基因中,3个为NRPS基因。【结论】4种腐烂病菌含有的碳水化合物活性酶的种类和数量相似,且都具有较强的果胶降解能力。不同腐烂病菌的膜转运蛋白中多药转运体的选择性扩增,以及次生代谢核心基因中NRPS类基因的特异性存在和缺失,表明它们作为重要的致病因子很可能在腐烂病菌寄主选择中发挥了重要的作用。     

水稻白叶枯病菌基因XOO2193的突变体构建及其毒力和胞外多糖分析

水稻白叶枯病菌是一种引起水稻白叶枯病的植物病原细菌,水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一.本研究采用携带同源序列的自杀质粒pK18MobGⅡ整合的办法构建了水稻白叶枯病菌中国菌株13751编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因XOO2193的非极性突变体GNM2193.对突变体的表型分析发现其毒力在杂交水稻品种特优63上显著减弱,突变体在非寄主植物蓖麻上不能引起过敏反应.此外,突变体胞外多糖的产量是野生型的43.4%.用一段含有XOO2193基因的DNA 片段对GNM2193进行功能互补,互补菌株在水稻上的毒力、引起过敏反应的能力和胞外多糖产量恢复到野生型水平.说明XOO2193基因与病菌的毒力和胞外多糖的产生有关.     

枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白的分离纯化及其部分性质的研究

拮抗菌（Bacillussubtilis）BS-98菌株在BPY液体培养基中产生的蛋白质经硫酸铵分级盐析、SephsdexG-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析和SephadexG－100柱再层析后,分离纯化得到的抗菌蛋白在电泳中显现出三条带。经初步纯化的抗菌蛋白对热稳定,对蛋白酶部分敏感。抑菌谱测定表明,抗菌蛋白对芦笋茎枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、灰霉菌、立枯丝核菌等病原真菌及黄瓜角斑病菌都具有强烈的抑制作用。     

鸭C4BPα的克隆、表达及其与鸭疫里默氏菌的互作

为研究鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)与鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)的相互作用,对鸭C4BPα进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,并利用间接免疫荧光试验及斑点杂交试验验证C4BP与RA的相互作用。结果显示,鸭C4BPα核苷酸序列全长为1230bp,与鸡C4BPα的相似性最高(82.1%);系统进化树分析发现,鸭C4BPα与鸡C4BPα处于同一系统进化树分支上,两者遗传进化关系最近;C4BPα在大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中能高效表达,重组蛋白以胞内可溶性形式存在;多克隆抗体效价超过1∶10000,并且可以与重组蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验和斑点杂交试验结果显示RA与鸭C4BP可以发生相互作用。研究结果为进一步揭示RA的致病机制奠定了基础。     

炭样小单孢菌产抗生素对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理

【背景】水稻细菌性条斑病菌为水稻细菌性条斑病的病原菌,土壤中分离到的一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1,其发酵产物(即抗生素JX)对植物病原菌具有较强的抑菌活性。【目的】研究抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理。【方法】采用杯碟法测定抑菌圈大小,二倍稀释法测定最低抑菌浓度、最低杀菌浓度,并且从菌体形态观察、电导率变化、培养液大分子漏出、蛋白质合成、核酸合成和膜电位变化6个方面探究其作用机理。【结果】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径达18.84±0.28mm,最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为1.39μg/m L和2.78μg/mL,且杀菌速度很快,作用12 h的杀菌率达100%。在抗生素JX作用下,水稻细菌性条斑病菌的细胞形态发生改变,培养液电导率、膜电位和大分子漏出量均随抗生素浓度增加而增大,但菌体蛋白质含量随着抗生素浓度增加而降低,同时,通过实时荧光定量PCR方法检测发现ef-p表达量下调。【结论】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌具有较强的抗菌作用,推测其抑菌机理是通过抑制菌体蛋白质的生物合成和影响细胞膜完整性而起作用。     

海南非洲菊根腐病病原的分离与鉴定

从海南省五指山市非洲菊苗圃,儋州市兰花基地非洲菊苗圃的腐烂病根上采集分离到9个疫霉菌株,经鉴定属于隐地疫霉Phytophthora cryptogea。     

中国橡胶树疫霉种的研究*

疫病是我国植胶区的主要病害。近年来,作者从云南西双版纳和广东海南岛的橡胶树和胶园土共分离出57株疫霉菌种。通过分类研究,共鉴定出4个种:恶疫霉 Phytophthoracactorum(Leb.＆ Cohn)Schroeter,辣椒疫霉 P.capsici Leoman,柑桔褐腐疫霉 P.citrophthora(Sm.＆ Sm.)Leonian,和棕榈疫霉 P.palmivora(Butl.)Butler。其中辣椒疫霉是首次在橡胶树上发现。我国橡胶树疫霉的种群结构与东南亚和南亚的有所不同,除棕榈疫霉外,其余3种在东南亚和南亚均未发现。而东南亚常见种:簇囊疫霉(P.botryosa)、橡胶疫霉(P.heveae)和蜜色疫霉(P.meadii),在我国却迄今尚未发现或有待证实。以前报道分离自胶园土壤中的芋疫霉(P.colocasiae),可能系柑桔褐腐疫霉之误。绝大多数分离物经配对培养均可产生性器官:辣椒疫霉的A~1交配型和A~2交配型大致相等;柑桔褐腐疫霉和棕榈疫霉的A~2交配型则明显多于A~1交配型。     

一种适用于双向电泳分析的高效真菌线粒体提取及蛋白质制样方法

用液氮冷冻研磨法破碎真菌菌丝细胞,通过差速和蔗糖密度梯度离心分离纯化板栗疫病菌线粒体,所得线粒体产率(质量比)约为1/10~4。电子显微镜观察和蛋白印迹表明,所制备的线粒体完整性好,没有检测到其它细胞成分的污染。使用膜蛋白裂解液溶解线粒体制备蛋白样品,将蛋白样品200μg上样于pH3~10,24cm的非线性胶条进行等电聚焦,电聚焦后再进行第二向SDS-PAGE电泳分离,经银染获得重复性好、背景清晰、分辨率高(680±15个蛋白质点)的凝胶图谱。随机选择10个蛋白质点进行质谱分析,9个获得有效注释,均为线粒体特异性蛋白质,表明所制备的蛋白样品非常适合双向电泳分析及其后续的质谱鉴定。